肺腺癌组织中ANGPT1mRNA的表达及临床意义

赵一帆肖春阳冼磊

作者单位：530021 南宁1广西医科大学第一附属医院胸外科；2广西医科大学研究生院

临床研究

肺腺癌组织中ANGPT1mRNA的表达及临床意义

赵一帆1，2肖春阳2冼磊1

作者单位：530021 南宁1广西医科大学第一附属医院胸外科；2广西医科大学研究生院

目的探讨血管生成素1（angiopoietin-1，ANGPT1）在肺腺癌组织中的表达及其临床意义。方法 采用实时荧光定量PCR法检测ANGPT1 mRNA在51例肺腺癌（lung adenocarcinoma，LAC)组织及其相应癌旁正常组织和11例非肿瘤正常肺组织中的表达，分析ANGPT1mRNA表达与肺腺癌患者临床病理特征的关系。结果ANGPT1mRNA在肺腺癌组织中的相对表达量为0.068±0.044，在相应癌旁正常组织中为0.696±0.157，在非肿瘤正常肺组织中为1.158±0.332，三者差异有统计学意义（F=114.34，P＜0.05）。ANGPT1 mRNA表达与肺腺癌患者年龄、性别、分化程度无关（P＞0.05），与淋巴结转移、TNM分期有关（P＜0.05)。结论ANGPT1 mRNA在肺腺癌组织中呈低表达，与淋巴结转移、TNM分期存在相关性，ANGPT1缺失可能与肺腺癌的发生发展有关。

肺肿瘤；肺腺癌；血管生成素1；实时荧光定量PCR

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其中大部分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），目前肺腺癌已超越鳞癌成为发病率最高的病理类型［1-2］。血管生成素1（angiopoietin-1，ANGPT1）是血管生成素家族中的一员，研究表明ANGPT1表达异常与喉癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌和口腔鳞状细胞癌等多种肿瘤相关［3-4］。但ANGPT1与肺腺癌的相关研究较少，本研究通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法检测肺腺癌组织及其相应癌旁正常组织、非肿瘤正常肺组织中ANGPT1mRNA的表达，并分析其与肺腺癌临床病理特征的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集广西医科大学第一附属医院胸外科2015年5月至2016年7月收治的肺腺癌手术切除癌组织51例及其相应癌旁正常组织，并收集非肿瘤正常肺组织（来自肺大疱、结核、支气管扩张等）11例。所有组织均为患者确诊活检组织，经病理学确诊为肺腺癌或炎性组织。其中男性38例，女性13例。年龄37～78岁，平均年龄（57.74±10.18）岁。按TNM分期（第8版）标准玉期21例，Ⅱ期18例，Ⅲ期9例，Ⅳ期3例；伴淋巴结转移28例；低分化18例，中分化22例，高分化11例。癌组织取自原发灶，同时在距原发灶5 cm处取癌旁正常组织。标本获取后立即放入无酶1.5 mL EP管中，液氮冷却，置-80℃冰箱保存。所有患者均行外科手术治疗，术前均未行放疗和化疗。本试验通过广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂

ABIStepone plus荧光定量PCR仪购自美国应用生物系统公司，Nano Drop 2000分光光度计和5417R台式冷冻高速离心机、-80℃低温冰箱、逆转录试剂盒购自Thermo公司；AxyGen总RNA提取试剂盒购自杭州爱思进生物技术有限公司；荧光定量PCR试剂盒购自北京天根生化科技公司。

1.3 引物设计与合成

根据Genebank人类ANGPT1、RPLPO基因cDNA序列，采用引物设计软件Primer 5设计引物。ANGPT1引物由上海英潍捷基有限公司合成，RPLPO引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。ANGPT1引物序列：上游为5′-AGCGCCGAAGTCCAGAAAAC-3′，下游为5′-TACTCTCACGACAGTTGCCAT-3′；内参RPLPO引物序列：上游为5′-CCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3′，下游为5′-TCAGCAAGTGGGAAGGTGTA-ATC-3′。

1.4 实验方法

提取组织中RNA，核酸蛋白测量仪检测抽提RNA质量和浓度，要求A260/A280在1.8～2.0之间，并计算RNA含量。按照逆转录盒说明书所示条件步骤将RNA逆转录为cDNA。合成的cDNA置于-20℃保存，同一时间进行实时荧光定量PCR检测。以RPLPO为内参，在ABIStepone plus荧光定量PCR仪上进行检测。反应体系为20μL：SYBR Green Master 10μL、上下游引物各1μL、RNA-free H2O 6μL、cDNA模板2μL。反应条件：95℃预变性、15 min，95℃、变性10 s，60℃退火/延伸32 s，共40个循环。每个样本均平行检测3个孔。PCR结束后，按常规方法行琼脂凝胶电泳，检测扩增出的PCR产物。得到数据采用2-△△Ct计算。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行处理。计量资料用均数±标准差（±s）表示，两两比较采用t检验；ANGPT1mRNA在肺腺癌组织及其相应癌旁正常组织和非肿瘤正常肺组织中的表达差异采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同肺组织中ANGPT1mRNA的表达

ANGPT1mRNA在肺腺癌组织中的相对表达量为0.068±0.044，在相应癌旁正常组织中为0.696±0.157，在非肿瘤正常肺组织中为1.158±0.332，三者差异有统计学意义（F=114.34，P＜0.05）。见图1。ANGPT1 PCR产物长度大概为150 bp，内参RPLPO PCR产物长度大概为100 bp，与生物数据库长度大致相等，说明所得产物为目的产物。见图2。

图1 ANGPT1 mRNA在不同肺组织中的表达

图2 PCR产物琼脂电泳图

2.2 肺腺癌中ANGPT1mRNA的表达与临床病理特征的关系

ANGPT1mRNA表达与患者性别、年龄、分化程度均无明显相关性（P＞0.05）。但与淋巴结转移和TNM分期有关，玉+Ⅱ期、无淋巴转移患者ANGPT1 mRNA表达量明显高于 Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移的患者（P＜0.001）。见表1。

表1 肺腺癌组织中ANGPT1 mRNA的表达与临床病理特征的关系（±s）

表1 肺腺癌组织中ANGPT1 mRNA的表达与临床病理特征的关系（±s）

临床病理特征 n ANGPT1 mRNA表达量 t P性别 1.160 0.264男38 0.145±0.054女13 0.175±0.086年龄（岁） 1.607 0.118＜60 29 0.140±0.048≥60 22 0.170±0.079分化程度 1.655 0.105中分化+高分化 33 0.163±0.070低分化 18 0.135±0.050 TNM分期 4.666 ＜0.001玉+Ⅱ期 39 0.201±0.084Ⅲ+Ⅳ期 12 0.084±0.034淋巴结转移 15.841＜0.001无23 0.226±0.054有28 0.032±0.032

3 讨论

肺癌发病率和致死率在所有恶性肿瘤中位列首位［1］，新增病例中近一半来自亚洲，而其中大部分来自中国。肺癌分为NSCLC和小细胞肺癌两大类，其中超过八成的肺癌为NSCLC，腺癌已经成为我国肺癌最常见的病理类型［2］。肿瘤侵袭转移是多步骤、多阶段的复杂病理过程，在生长、转移过程中均需要丰富的血液供应。大量研究表明，肿瘤的发生发展与有效的血管形成密切相关，较高的微血管密度不仅与更高的肿瘤分期及早期复发有关，也与较高的肿瘤转移率及较短的无瘤生存期有关［5］。

血管生成素（angiopoietin，ANGPT）-TIE信号系统是独立于传统血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）以外且在肿瘤血管形成中有重要意义的一个系统。ANGPT-TIE系统主要包括其配体ANGPT及受体 TIE（Tie1和Tie2），ANGPT又包括ANGPT1、ANGPT2、ANGPT3和 ANGPT4。ANGPT1是Tie2的激动剂，ANGPT2是ANGPT1的拮抗剂［6］。ANGPT1主要在周细胞、成纤维细胞及非血管性细胞中表达，分泌的糖蛋白通过诱导内皮细胞酪氨酸磷酸化激活受体而在血管发育和生成方面起重要作用［7］。现有研究表明ANGPT1异常表达与多种肿瘤发生发展密切相关［3-4］。但有关ANGPT1蛋白在肿瘤组织中的表达研究结果并不一致。赵磊等［8］采用免疫组化法检测ANGPT1在结直肠癌组织中的表达，结果显示在癌组织中阳性表达率为80.8%。Naumnik等［9］研究发现与正常人相比，NSCLC患者血清以及肺泡灌洗液中ANGPT1含量均增高。但王强［10］采用免疫组化法检测54例胃腺癌组织，发现ANGPT1在癌组织中低表达。本研究采用qRT-PCR法检测51例肺腺癌组织及其相应癌旁正常组织和11例非肿瘤正常肺组织中ANGPT1mRNA的表达，结果显示ANGPT1mRNA在肺腺癌组织中呈低表达状态，在相应癌旁正常组织中的表达量是肺腺癌组织的10.19倍，在非肿瘤正常肺组织中的表达量是癌旁组织的1.66倍，且差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步分析ANGPT1mRNA表达与肺腺癌临床病理特征的关系，发现ANGPT1 mRNA表达在晚期、转移患者中的表达量明显低于早期、无转移患者，提示ANGPT1低表达可能对肿瘤细胞转移有促进作用。吴平等［11］研究亦发现鼻咽癌中发生淋巴结转移者ANGPT1表达异常，可能通过参与肿瘤微淋巴管形成促进其转移，并可作为预测发生淋巴结转移的风险因子及抗淋巴结转移的潜在治疗靶点，但对于ANGPT1影响肿瘤发生发展的认识目前尚未统一［12-13］。

综上所述，本研究发现ANGPT1mRNA在肺腺癌组织中的表达低于正常组织，并与患者TNM分期、淋巴结转移有关，有望成为肺癌治疗的一个潜在靶点，但具体作用机制需进一步研究加以阐明。

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［2017-02-24收稿］［2017-03-28修回］［编辑 罗惠予］

Expression and clinical significance of angiopoietin-1mRNA in lung adenocarcinoma

Zhao Yifan2，Xiao Chunyang2，Xian Lei1（1Department of Thoracic Surgery，First Affiliated Hospital Guangxi Medical University；2Graduate School of GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

Xian Lei.E-mail：xianlei59@163.com

Objective To observe changes in angiopoietin-1（ANGPT1）expression in lung adenocarcinoma and investigate the potential clinical significance.Methods A total of 51 cancer tissue samples and adjacent normal tissues were collected from lung adenocarcinoma patients；in addition，11 non-cancer normal tissues were collected.Relative levels of ANGPT1 mRNA were assessed using quantitative real-time PCR，and possible relationships between ANGPT1 mRNA and clinicopathology were explored.Results Relative levels of ANGPT1 mRNA were 0.068±0.044 in lung adenocarcinoma tissue，0.696±0.157 in adjacent normal tissue，and 1.158±0.332 in non-cancer normal tissue（F=114.34，P＜0.05）.Levels of ANGPT1 mRNA in lung adenocarcinoma tissues were not related to gender，age，or degree of differentiation（P＞0.05），but they were related to TNM stage and lymphatic metastasis（P＜0.05）. Conclusion ANGPT1 expression is reduced in lung adenocarcinoma，whichmay be involved in disease onsetand development.

Lung neoplasms；Lung adenocarcinoma；Angiopoietin-1；Quantitative real-time PCR

R734.2

A

1674-5671（2017）02-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.02.11

广西自然科学基金资助项目（2013GXNSFAA019270）；广西壯族自治区教育厅高校科研资助项目（YB2014060）

冼磊。E-mail：xianlei59@163.com