抗1型血小板反应蛋白7A抗体与特发性膜性肾病的关系

夏虹+张久丹+吕杭丽+陈红波+何灵芝+张培培

[摘要] 目的 探讨抗1型血小板反应蛋白7A（Thrombospondin type 1 domain-containing 7A，THSD7A）抗体对特发性膜性肾病的诊断和疾病活动监测价值。 方法 本研究收集了经肾活检并确诊的IMN 127例，并以同期50例非IMN肾脏疾病为对照，采用半定量WB检测被试者血清中抗THSD7A抗体，采用定量ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）检测被试者血清中抗THSD7A抗体滴度。回顾性分析临床资料。 结果 利用WB方法，血清中抗THSD7A抗体在IMN中阳性率为7.1%；利用ELISA方法，血清中抗THSD7A抗体在IMN中阳性率为7.9%；抗体滴度水平越高，则低白蛋白血症越严重（P<0.05），24 h尿蛋白定量值越大（P<0.05）；eGFR下降越明显（P<0.05）。WB和ELISA两种方法的抗体检出率比较差异无统计学意义（P=0.5）。 结论 IMN中抗THSD7A抗体的检出率不高，该抗体对IMN诊断具有较高的特异性，诊断准确性良好。抗THSD7A抗体可反映IMN的活动性。

[关键词] 膜性肾病；抗1型血小板反应蛋白7A抗体；酶联免疫吸附测定

[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）15-0019-04

[Abstract] Objective To investigate the value of thrombospondin type 1 domain-containing 7A（THSD7A ） antibody in the diagnosis and disease activity monitoring of idiopathic membranous nephropathy（IMN）. Methods In this study， 127 cases of IMN diagnosed by renal biopsy were collected and 50 cases of non-IMN kidney disease in the same period were as control group. Semi-quantitative Western blot was used to detect anti-THSD7A antibody in serum. Quantitative ELISA（Enzyme-linked immuno sorbent assay） was used to detect anti-THSD7A antibody titers in the subjects' serum. The clinical data were retrospectively analyzed. Results The positive rate of anti-THSD7A antibody in IMN was 7.1% by WB method. The positive rate of anti-THSD7A antibody in IMN was 7.9% by ELISA. The higher the antibody titer level， the more severe the low albuminemia（P<0.05）， the larger the 24-hour urine protein quantitative value （P<0.05）， and the more obvious the eGFR（P<0.05）. There was no significant difference in antibody detection rate between WB and ELISA（P=0.5）. Conclusion The detection rate of anti-THSD7A antibody in IMN is not high. The antibody has high specificity for IMN diagnosis and good diagnostic accuracy. Anti-THSD7A antibodies can reflect the activity of IMN.

[Key words] Membranous nephropathy； Thrombospondin type 1 domain-containing 7A； Enzyme-linked immunosorbent assay

膜性腎病（Membranous nephmpathy，MN）是导致成人肾病综合征最常见的疾病之一，其发生率逐年递增[1]；其中特发性膜性肾病（Idiopathic membranous nephropathy，IMN）是一组病因不明的MN的总称，长期以来被认为是一种自身免疫病，但致病抗原和抗体一直没有得到明确。Beck等[2]在2009年发现血清中存在针对人类足细胞上磷脂酶A2受体（Phospholipase A2 receptor，PLA2R）的自身抗体，并指出该抗体可能是IMN的病因[3]，其在IMN的特异性很高[4，5]，总敏感性为52%～78%[6，7]。同时研究者们也发现，一部分IMN患者的血清中抗PLA2R抗体是阴性的，一部分继发性膜性肾病患者的血清中抗PLA2R抗体是阳性的[8]，说明还可能存在其他导致IMN的自身抗原和抗体。2014年，Tomas等[9]发现又一新的足细胞抗原，即THSD7A，其在IMN患者中阳性率约为2.5%～5%，最近的一次大样本检测显示其阳性率为2.6%[10]，在PLA2R非相关IMN的波士顿队列研究中阳性率高达8.18%[11]。本研究对成年IMN患者和同期非IMN患者血清中抗THSD7A抗体进行了检测，探讨该抗体对IMN的诊断和病情活动监测价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 IMN组 收集2010年1月～2016年1月在我院行肾活检并确诊的IMN患者127例。纳入标准：病理符合膜性肾病，肾活检时留存血清标本，临床资料完整。排除标准：病理表现不典型，或者有明确及可疑继发因素。

1.1.2 非IMN组 随机选取同期其他经肾活检确诊的肾脏病理类型患者50例，男23例，女27例，平均年龄（40.2±15.6）岁。其中继发性膜性肾病7例，狼疮性肾炎15例，微小病变型肾病2例，新月体肾炎3例，IgA肾病23例。本研究获得我院伦理审查委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1临床资料收集 包括基本信息、详细病史及治疗情况、实验室检查结果等。实验室检查结果包括尿指标（24 h尿蛋白定量）和血指标（血尿、血肌酐、尿素氮、血浆白蛋白、自身抗体、补体、免疫球蛋白、肿瘤指标）等。

1.2.2 GFR估计值（eGFR） 采用慢性肾脏病流行病学合作研究（CKD-EPI）公式计算，具体为：（1）男性：①若血肌酐≤0.9 mg/dL，则采用公式GFR=144×（血肌酐/0.9）-0.411×0.993年龄；②若血肌酐>0.9 mg/dL，则采用公式GFR=141×（血肌酐/0.9）-1.209×0.993年龄；（2）女性：①若血肌酐≤0.7 mg/dL，则采用公式GFR=144×（血肌酐/0.7）-0.329×0.993年龄；②若血肌酐>0.7 mg/dL，则采用公式GFR=144×（血肌酐/0.7）-1.209×0.993年龄。上述公式中的血肌酐单位均为mg/dL。

1.2.3 血清标本收集 肾活检同一时期留存所有研究对象的血清标本，所有标本放置-80°冰箱保存备用。

1.2.4 抗THSD7A抗体检测 （1）采用ELISA对所有血清标本进行抗体滴度检测（美国Antibodies公司，货号ABIN2539542），操作按说明书进行，抗THSD7A抗体滴度<3 pg/mL判定为阴性（为该试剂所能检测到最低下限）。（2）采用WB对所有血清标本进行抗体检测（Abcam公司货号ab121122），血清样品加上上样缓冲液，混匀，100°C煮5 min，将制备的血清蛋白样品80V电泳30 min后，改用120V电泳120 min，再将分离胶上的蛋白转至硝酸纤维素膜上，再分别孵育一抗、二抗，洗涤后用增强的化学发光液显色，在凝胶图像分析系统照相扫描蛋白条带的吸光带。

1.3 统计学分析

利用统计学软件SPSS 20.0进行统计学处理。计量资料采用（x±s）表示，相应的组间比较采用t检验或方差分析；非正态、方差不齐资料的组间比较采用非参数秩和检验。对于计数资料以百分比或频数表示，组间比较采用χ2检验。IMN诊断准确性分析以肾活检病理为金标准绘制ROC曲线。ELISA和WB两种方法对抗体检出率差异比较采用Mcnemar检验，ELISA和WB两种方法对抗体检出率一致性比较采用Kappa检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料

见表1。IMN组和非IMN组患者临床资料以及WB、ELISA两种方法检测的两组患者中抗THSD7A抗体的阳性率。

2.2 IMN组患者不同临床情况抗THSD7A抗体阳性率

见表2。根据年龄范围、性別、血白蛋白、24 h尿蛋白定量、病理分期以及免疫抑制剂的使用情况分别分组，统计出不同项目分组中抗THSD7A抗体的阳性例数及百分比。

2.3 不同抗THSD7A抗体滴度的IMN患者白蛋白、24 h尿蛋白定量以及eGFR情况

见表3。抗体滴度水平越高，则低白蛋白血症越严重（P<0.05），24 h尿蛋白定量值越大（P<0.05），eGFR下降越明显（P<0.05）。

2.4 抗THSD7A抗体对IMN诊断的准确性

以肾活检病理结果为金标准，利用ELISA检测比较抗THSD7A抗体对IMN诊断的准确性（图1）。抗THSD7A抗体诊断IMN的敏感性为7.9%，特异性为98%。Youden指数为0.059。抗THSD7A抗体诊断IMN的AUCROC为0.529，95%CI 0.437～0.622。

2.5 WB和ELISA对抗THSD7A抗体检出率的差异性、一致性比较

见表4。两种方法抗体检出率比较差异无统计学意义（P=0.5），两种方法抗体检出率有较好一致性（Kappa=0.894，P<0.001）。

3 讨论

本研究中，我们利用WB和ELISA两种方法来检测不同类型肾脏病患者血清中抗THSD7A抗体，其检出率分别为7.1%和 7.9%，WB方法检出的抗体阳性患者均来自于IMN患者，ELISA方法检出的抗体阳性患者有且仅有1例来自于非IMN患者。我们进一步分析抗THSD7A抗体阳性的IMN患者，其白蛋白水平、24 h尿蛋白定量以及eGFR值随抗体滴度升高的变化情况，我们发现抗体滴度水平越高，低白蛋白血症越严重，24 h尿蛋白定量值越大，eGFR下降越明显，且3个抗体滴度两两比较，上述三项指标差异均具有统计学意义。本研究对WB和定量ELISA进行了检出率差异性和一致性的比较，结果显示，两者对抗体的检出率无差异，一致性良好。

Tomas[9]和Larsen等[12]所报道的欧美IMN患者的抗THSD7A抗体阳性率为2.5%～5%，Iwakura等[13， 14]报道，日本IMN患者中抗THSD7A抗体阳性率为9.1%，本研究中我们得到的结果是7.9%，在文献报道的范围之内。在2016年的另一篇文章里，同样是在日本IMN患者中，Norifumi等[15]的研究得到抗THSD7A抗体阳性率为3.4%，与Iwakura等[14]的研究结果相比明显偏低，推测可能与检测方法、样本量、患者血清采集时间等不同有关。

閱读相关其他文献，并结合我们自身的研究结果，发现IMN患者中抗THSD7A抗体总体检出率不高，不同的研究中，涉及到的检测方法不同，主要包括WB、免疫荧光和免疫组化，得到的结果均在10%以内。分析检出率低的原因可能为：①存在导致IMN的其他种类足细胞自身抗原抗体系统，这一点已得到证实，据报道约75%的IMN患者的血清中抗磷脂酶A2受体（PLA2R）抗体是阳性的[16]，可能还有醛糖还原酶、超氧化物气化酶、α-烯醇酶等[17-19]；②病情缓解：如果抗体检测前患者已接受免疫抑制剂治疗或自发缓解，此时抗体可能已经转阴；③样本量不足；④实验条件不足；⑤潜在继发因素未发现，即虽被诊断为IMN，实际上仍存在未被发现的潜在激发因素。

本研究中选取50例非IMN患者作为对照，WB检测所有上述患者的抗THSD7A抗体均为阴性，我们发现该抗体的特异性为100%，与文献报道基本一致[9]。因此，抗THSD7A抗体可作为IMN与非IMN的鉴别诊断标志物。不过该抗体在鉴别IMN和继发性MN是也存在一些未解决的难点，如本研究中有1例继发性MN患者的抗THSD7A抗体（ELISA方法检出）是阳性，排除实验误差可能，结合其临床资料，仍不能判断该患者膜性肾病类型。文献也有类似报道，Hoxha等[20]报道了一例抗THSD7A抗体相关的肿瘤患者，抗体阳性且肾组织、肿瘤组织、淋巴结的THSD7A抗原异常高表达。临床中我们会遇到部分膜性肾病合并恶性肿瘤、HBV等可疑继发因素，临床倾向于继发性MN，但无法除外IMN。一种观点认为两者是无关联的并存疾病；一种观点则认为两者虽无直接因果关系，但也不是完全无关，感染、肿瘤、自身免疫病可引起机体内环境改变，足细胞受内环境影响可出现THSD7A抗原表达异常，同时机体免疫出现紊乱产生针对该抗原的自身抗体，从而导致膜性肾病发生；这些观点均有待进一步研究去验证。

本研究发现，抗体滴度水平越高者，低白蛋白血症越严重，24 h尿蛋白定量值越大，eGFR下降越明显。Tomas等[9]也有类似发现，进一步提示抗THSD7A抗体可反映IMN的活动性。

目前国内外抗THSD7A抗体检测尚无统一、标准的方法，文献报道的有WB、免疫组化、免疫荧光等。WB操作复杂，成本高，不太适合临床推广使用。ELISA可操作性相对较强，同时可观察滴度的变化，临床实用性更大。本研究对WB和ELISA进行了比较，结果显示两者对抗体的检出率无差异，一致性良好，综合分析ELISA更适合临床推广运用。

本研究仍存在以下不足，纳入研究病例数较少，地域单一，研究结论上不能代表绝大多数患者情况。本研究尚没有进行长期随访，不能明确抗体与预后转归的关系，更深一步的研究有待开展。

总之，本研究证实了IMN患者中抗THSD7A抗体明确存在，该抗体对IMN诊断具有较高的特异性，可反映IMN的活动性，作为IMN又一新的分子标记物，为IMN靶向治疗提供了理论支持和新的研究方向。

[参考文献]

[1] Pan X，Xu J，Ren H，et al. Changing spectrum of biopsy-proven primary glomerular diseases over the past 15 years：A single-center study in China[J]. Contrib Nephrol，2013， 181：22-30.

[2] Beck LH，Bonegio RG，Lambeau G，et al. M-type phospholipase A2 receptor as target antigen in idiopathic membranous nephropathy[J]. N Engl J Med，2009，361（1）：11-21.

[3] Cattran DC，Brenchley PE. Membranous nephropathy：Integrating basic science into improved clinical management[J]. Kidney Int，2017，91（3）：566-574.

[4] Du Y，Li J，He F，et al. The diagnosis accuracy of PLA2R-AB in the diagnosis of idiopathic membranous nephropathy：A meta-analysis[J]. PLoS One，2014，9（8）：e104936.

[5] Qin W，Beck LH，Zeng C，et al. Anti-phospholipase A2 receptor antibody in membranous nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol，2011，22（6）：1137-1143.

[6] Hoxha E，Kneissler U，Stege G，et al. Enhanced expression of the M-type phospholipase A2 receptor in glomeruli correlates with serum receptor antibodies in primary membranous nephropathy[J]. Kidney Int，2012，82（7）：797-804.

[7] Coenen M J，Hofstra J M，Debiec H，et al. Phospholipase A2 receptor（PLA2R1） sequence variants in idiopathic membranous nephropathy[J].J Am Soc Nephrol，2013，24 （4）：677-683.

[8] Stehle T，Audard V，Ronco P，et al. Phospholipase A2 receptor and sarcoidosis-associated membranous nephro-pathy[J]. Nephrol Dial Transplant，2015，30（6）：1047-1050.

[9] Tomas NM，Beck LH，Meyer-Schwesinger C，et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy[J]. N Engl J Med，2014，371（24）：2277-2287.

[10] Hoxha E，Beck LH，Wiech T，et al. An indirect immunofluorescence method facilitates detection of throm-bospondin type 1 domain-containing 7A-specific antibodies in membranous nephropathy[J]. J Am Soc Neph-rol，2017，28（2）：520-531.

[11] Nicola M.Tomas LHB，Catherine Meyer-Schwesinger，et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy[J]. The New England Journal of Medicine，2014，371：2277-2287.

[12] Larsen CP，Cossey LN，Beck LH. THSD7A staining of membranous glomerulopathy in clinical practice reveals cases with dual autoantibody positivity[J]. Mod Pathol，2016，29 （4）：421-426.

[13] De Vriese AS，Glassock RJ，Nath KA，et al. A proposal for a serology-based approach to membranous nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol，2017，28 （2）：421-430.

[14] Iwakura T，Ohashi N，Kato A，et al. Prevalence of enhanced granular expression of thrombospondin type-1 domain-containing 7A in the glomeruli of Japanese patients with idiopathic membranous nephropathy[J]. PLoS One，2015，10（9）：e0138841.

[15] Norifumi H，Yuki M，Junko I，et al. Prevalence of m-type phospholipase A2 receptor （PLA2R）and thrombospondin type-1 domain-containing 7A（THSD7A）in the glomerular deposits of Japanese membranous nephropathy[J]. Nephrology Dialysis Transplantation，2016，36（12）：321-330.

[16] Mastroianni-Kirsztajn G，Hornig N，Schlumberger W. Autoantibodies in renal diseases-clinical significance and recent developments in serological detection[J]. Front Immunol，2015，6：221.

[17] Murtas C，Bruschi M，Candiano G，et al. Coexistence of different circulating anti-podocyte antibodies in membranous nephropathy[J]. Clin J Am Soc Nephrol，2012，7 （9）：1394-1400.

[18] Bruschi M，Carnevali ML，Murtas C，et al. Direct characterization of target podocyte antigens and auto-antibodies in human membranous glomerulonephritis：Alfa-enolase and borderline antigens[J]. J Proteomics，2011，74（10）：2008-2017.

[19] Prunotto M，Carnevali ML，Candiano G，et al. Autoimmunity in membranous nephropathy targets aldose reductase and SOD2[J]. J Am Soc Nephrol，2010，21 （3）：507-519.

[20] Hoxha E，Wiech T，Stahl PR，et al. A mechanism for cancer-associated membranous nephropathy[J]. N Engl J Med，2016，374（20）：1995-1996.