脑胶质瘤患者脑脊液中HOXA13、Plexin—B2的定量分析及生物学意义研究

孙虎+沈峥+郑玲燕+龚杰

[摘要] 目的 探讨同源基因A-13（homeotic genes-A13，HOXA13）和神经丛素-B2（Plexin-B2）在脑胶质瘤中的表达情况及生物学意义。 方法 收集2014 年5月～2016年2月间我院诊断的脑胶质瘤患者60例，使用 qRT-PCR技术分别检测实验组（脑胶质瘤患者）和对照组（健康受试者）血清中S100、HOXA13和Plexin-B2的表达水平，并分析HOXA13和Plexin-B2在不同级别脑胶质瘤患者中的表达情况，分析其与肿瘤恶性程度的关系。 结果 与对照组对比，实验组的HOXA13和Plexin-B2在脑脊液及血浆中表达水平显著升高[血液中：HOXA13，（1.21±0.14） vs 0；Plexin-B2：（1.57±0.33） vs 0；脑脊液中：Plexin-B2：（4.87±1.13） vs 0；Plexin-B2：（5.88±0.21） vs 0]，肿瘤体积越大、分化程度越低，血液中HOXA13和Plexin-B2表达水平越高；脑脊液中HOXA13和Plexin-B2蛋白水平明显高于血浆中。 结论 脑胶质瘤患者中HOXA13和Plexin-B2表达上调，且与肿瘤恶性程度有显著关系，脑脊液中HOXA13和Plexin-B2表达显著升高，可用作脑胶质瘤恶性程度的标志物。

[关键词] 脑胶质瘤；同源基因A-13；神经丛素-B2；qRT-PCR

[中图分类号] R739.41 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）15-0023-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and biological significance of gomeotic genes-A13（HOXA13） and neuronal-B2（Plexin-B2） in gliomas. Methods 60 patients diagnosed with glioma were diagnosed in our hospital from May 2014 to February 2016 were chosen. The serum expression levels of S100， HOXA13 and Plexin-B2 in the experimental group（glioma patients） and the control group（health volunteers） were measured by qRT-PCR. And the expression of HOXA13 and Plexin-B2 in different stages of glioma patients was analyzed， the relationship with the degree of tumor malignancy was analyzed. Results Compared with those of the control group， the expression levels of HOXA13 and Plexin-B2 in cerebrospinal fluid and plasma were significantly higher[blood： HOXA，13，（1.21±0.14） vs 0； Plexin-B2， （1.57±0.33） vs 0； cerebrospinal fluid： Plexin-B2， （4.87±1.13） vs 0； Plexin-B2， （5.88±0.21） vs 0]. The larger the tumor volume， the lower the degree of differentiation and the higher the expression level of HOXA13 and Plexin-B2 in the blood. The levels of HOXA13 and Plexin-B2 protein in cerebrospinal fluid were significantly higher than those in plasma. Conclusion The expression of HOXA13 and Plexin-B2 in brain glioma patients is up-regulated and is significantly correlated with the degree of malignancy. The expression of HOXA13 and Plexin-B2 in cerebrospinal fluid is significantly increased and can be used as a marker of malignant degree of glioma.

[Key words] Glioma； HOXA13； Plexin-B2； qRT-PCR

腦神经胶质瘤是脑肿瘤中最常见的恶性肿瘤，是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。全国肿瘤防治办公室最近发表的统计结果，脑肿瘤调整死亡率列为第十位主要的恶性肿瘤，在大城市的发病率男性女性均为第十位[1，2]，因此寻找特征性生物标记物用来诊断脑胶质瘤至关重要。本研究通过检测血浆及脑脊液中HOXA13和Plexin-B2蛋白的表达，探讨HOXA13和Plexin-B2在脑胶质瘤的生物学意义，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 一般资料

收集从2014 年5月～2016 年2 月在我院神经外科接受治疗的脑胶质瘤患者60例（实验组），30例健康受试者（对照组），所有患者均通过病理诊断证实。入选标准：病理诊断明确，患者知情同意。排除标准：合并其他严重并发症影响实验过程；严重肝肾功能损害；妊娠及哺乳期妇女。根据2014年中国脑胶质瘤分子诊疗指南分级，其中脑胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级30例，脑胶质瘤Ⅲ～Ⅳ级30例。患者一般情况比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表1。已告知患者实验内容和实验目的，并签署知情同意书。

1.2 总RNA提取

PCR引物采用Primer 5.2设计S100：Forward Primer：AAGGATGCCGTGGATAAATTGC；Reverse Pri-mer：ACACGATGAACTCACTGAAGTC；HOXA13：For-ward Primer：CTCCCGCGCTAAGGAGTTC；Reverse Pri-mer：CCGGCACCACTGGCATATC；Plexin-B2：Forward Primer：ATGCCAACTCCCTCTCCTG；Reverse Primer：CTAGGCGTATT TCCACGATGC。所有引物由上海生物工程公司合成。收集不抗凝血液3～5 mL，保存4℃冰箱中，在恒温离心机中，以4℃、3500 r离心10 min，收集上层血清，以200 uL/管分管编号冻存-80℃冰箱中。总RNA提取试剂盒由百泰克公司提供。RT-PCR试剂盒为日本Takara公司生产。按照总RNA提取试剂盒提取所有患者血浆及脑脊液中的总RNA，根据RT盒的说明书操作，以OLIGO进行cDNA 的合成。

1.3 qRT-PCR

基因表达用SYBR GREEN I荧光定量PCR在iQTM5上进行监测，结果用该仪器进行分析。结果重复3次。反转录条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。

1.4 观察指标

实验组和对照组血浆及脑脊液中S100、HOXA13和Plexin-B2的表达差异；不同级别胶质瘤S100、HOXA13和Plexin-B2蛋白的表达差异。若患者血浆及脑脊液中分别能够检测出S100、HOXA13和Plexin-B2蛋白，则记为该项蛋白表达阳性；反之，记为阴性。

1.5 统计学方法

采用SPSS13.0统计学软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1两组受试者血浆及脑脊液中S100、HOXA13和Plexin-B2的表达情况

健康受试者血浆中S100表达高于脑胶质瘤患者[（6.98±0.23） vs （1.01±0.19），t=1.908，P<0.05]，未检测出HOXA13和Plexin-B2。而脑胶质瘤患者中HOXA13和Plexin-B2基因表达水平增加，无论是血浆[HOXA13：（1.21±0.14）；Plexin-B2：（1.57±0.33）]还是脑脊液[Plexin-B2：（4.87±1.13）；Plexin-B2：（5.88±0.21）]中均明显上调。脑脊液中两者表达水平高于血浆中（t=2.571，P<0.01）。见图1。

2.2 两组S100蛋白的表达情况

在健康受试者血清及脑脊液中均可以检测出S100蛋白。脑胶质瘤患者随恶性程度升高，S100蛋白阳性率患者逐渐减少（χ2=1.773，P<0.05），见表2。

2.3 实验组中不同级别胶质瘤患者HOXA13蛋白的表达情况

在健康受试者血清及脑脊液中不表达HOXA13蛋白。脑胶质瘤患者表达HOXA13蛋白，且随恶性程度升高，HOXA13蛋白阳性率患者逐渐增加（P<0.05）。见表3。

2.4 实验组中不同级别胶质瘤患者Plexin-B2蛋白的表达情况

在健康患者血清及脑脊液中Plexin-B2蛋白基本不表达。脑胶质瘤患者Plexin-B2蛋白的表达显著升高，且随恶性程度升高，Plexin-B2蛋白阳性率患者逐渐增加（χ2=3.112，P<0.05）。见表4。

3 讨论

脑神经胶质瘤是脑肿瘤中最常见的恶性肿瘤，严重危害人类健康，发病率仍然居高不下，因此做好脑胶质瘤的早期发现、早期诊断至关重要。胶质瘤是肿瘤形成的异质组这占大多数原发性肿瘤中枢神经系统；尽管由辐射和化疗后手术切除组合治疗取得进展，预后良好的患者疗效仍然令人沮丧，与诊断后的中位数存活约15个月[3-4]。因此，有必要进行识别对胶质瘤阶段特异的新型生物标志物。尽管近年来随着影像学的发展，胶质瘤的诊断、治疗有了长足的进展，但其总体疗效并无明显改善，手术后5年生存率仍在6%左右[5-6]。

S100蛋白是一个酸性的Ca2+结合蛋白家族，参与细胞内和细胞外的因子调节，钙离子对S100蛋白发挥生物学效应至关重要[7]。S100蛋白参与许多细胞内外功能，如调节细胞内环境Ca2+稳态、细胞增殖与凋亡、细胞侵袭、蛋白磷酸化、细胞支架构成、自身免疫和炎症[8]。研究表明S100蛋白与肿瘤增殖呈现负相关关系[9]。本实验结果表明，患者病变越严重，病理级别越高，S100蛋白越少，提示S100蛋白的较少或者沉默，S100蛋白的表达可能为治疗胶质瘤提供依据。

HOXA13首先在果蝇中发现，具有特征存在可识别的183个碱基对的DNA序列，其编码高度保守的61个氨基酸肽称为同源结构域[10-11]。HOXA13位于HOXA的5'端位点。最近的研究表明涉及HOXA13在癌发生和促进肿瘤生长。有些报道显示[12-13]异常HOXA13表达与肝细胞癌有关和HOXA13过表达提示肝癌患者易转移和不良预后。实验数据显示HOXA13基因与肿瘤恶性程度相关，恶性程度越高，该基因表达越高。研究表明HOX家族基因与肿瘤级别相关，且在胶质瘤中预示着预后不良[14]。HOXA13抑制胶质瘤细胞生长细胞系和异种移植模型[15]。

神经丛素B2（Plexin-B2）是一种跨膜受体，其参与响应于信号素的轴突引导和细胞迁移，参与肿瘤细胞侵袭和血管生成研究显示，胶质瘤患者的中位生存期不到2年，且预后不良，生活质量差[16-17]。Plexin-B2在胶质瘤生长和侵袭中发挥关键作用[18]。此外，近来对胶质瘤患者样品的分析鉴定了Plexin-B2作为高级胶质瘤的潜在生物标志物[19]。此外，既往研究已经建立Plexin-B2作为迁移的胚胎和成人神经前体细胞的重要调节器[20]。研究显示，Plexin-B2表达在人胶质瘤中上调，其表达水平与胶质瘤级别相关，机制可能为Plexin-B2激活改变肌动蛋白細胞骨架和促进胶质瘤细胞的迁移[21]。

综上所述，HOXA13和Plexin-B2可能是一种新型诊断和预测脑胶质瘤患者预后的标志物，作为潜在的预后生物标志物和高级别胶质瘤的新药物靶标的作用。

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