蛤蚧定喘丸中十种非法染色物的检测

罗轶　丘明明　何颂华

[摘要] 目的 建立高效液相色谱法（HPLC）检测蛤蚧定喘丸中非法添加色素金胺O、柠檬黄、胭脂红、日落黄、亮黄、酸性红、甲基橙、金橙Ⅱ、赤藓红、碱性橙的方法，并用LC-MS/MS确证。 方法 样品用50%乙醇溶液提取，HPLC测定，流动相为乙腈-0.01 mol/L乙酸铵溶液（含0.5%冰乙酸），梯度洗脱，检测波长420 nm和500 nm。用LC-MS/MS进行确证，流动相为乙腈-0.01 mol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱，离子源：ESI，扫描模式：正离子，在动态MRM模式下，以保留时间和质荷比对分离的组分给予定性。 结果 十种染色物线性相关系数均>0.999，定量限在0.3～2.8 μg/g，回收率为96.3%～101.1%，RSD为0.6%～1.5%。123批次样品33批次检出金胺O。 结论 液质联用法定性准确、可靠，液相色谱含量测定法简便、快速、准确，两者相结合可快速、准确、灵敏地检测出蛤蚧定喘丸中十种染色物。

[关键词] 蛤蚧定喘丸；非法染色；金胺O；高效液相色谱法；液质联用技术

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（c）-0139-05

[Abstract] Objective To establish a quantification method of HPLC for determining illegally added auramine O， lemon yellow， carmine， sunset yellow， brilliant yellow， acid red， methyl orange， orange Ⅱ， etythrosine and alkaline orange in Gejie Dingchuan Pills， and validate with LC-MS/MS method. Methods The sample was extracted by 50% ethanol， and determined by HPLC with a gradient elution of acetonitrile-0.01 mol/L ammonium acetate （contain 0.5% glacial acetic acid） and the detection wavelength was set at 420 nm and 500 nm. The identification was performed by LC-MS/MS， using a gradient elution of acetonitrile-0.01 mol/L ammonium acetate. The analytes were detected by an electro spray ionization tandem mass spectrometry with dynamic MRM. Qualitation of the auramine O based on the retention time and mass charge ratio. Results The calibration curve of ten dyes showed good linearity and correlation coefficients were all above 0.999， the limits of quantitation for ten dyes in samples were between 0.3-2.8 μg/g， and the average recoveries ranged from 96.3% to 101.1% with RSD of 0.6%-1.5%. Auramine O could be detected in 33 of 123 samples. Conclusion LC-MS/MS method is accurate and reliable for the qualitative identification and the HPLC method is simple， rapid and accurate for the content determination. The combination of HPLC and LC-MS/MS can detect ten dyes in Gejie Dingchuan Pills rapidly， accurately and sensitively.

[Key words] Gejie Dingchuan Pills； Illegal dyeing； Auramine O； HPLC； LC-MS/MS

近年来，部分不法商贩将质量较差或二次提取的药材经工业染料染色美化后，冒充或掺入质量较好的饮片中。这样的中药材（饮片）不仅治疗效果差，其带入的工业染料对人体的肝肾有毒副作用，甚至有致畸、致癌、致突变的作用[1-6]。因此，加强中药材（饮片）非法染色监管非常必要。

蛤蚧定喘丸以原粉入药，处方中含有黄连、黄芩等2味药材[7]，据报道[8-19]，市场上销售的黄连、黄芩常被非法染色，黄色、橙色和红色类着色剂占有较大比重[20]，而以上染色剂的检测尚无国家标准，不能检测生产企业是否以“染色药材（饮片）”投料并引入成药中，给用药安全带来隐患。因此，本文研究了十种染色物的HPLC定量检测方法，并对检出的成分用LC-MS/MS法确证，为违规使用“染色药材（饮片）”进行中成药生产的监管提供参考。

1 仪器与试药

1.1 儀器

Waters Acquity超高压高效液相色谱仪；Agilent LC-MS QQQ-6460质谱仪。

1.2 试药

对照试剂：金胺O（检查用，批号：111770-200701，含量为87.03%）、金橙Ⅱ（检查用，批号：111769-200701，含量为99.40%）、赤藓红（检查用，批号：111772-200701，含量为97.38%）、酸性红73（检查用，批号：111773-200701，含量为97.77%）、胭脂红（检查用，批号：111771-200701，含量为99.66%）均由中国食品药品检定研究院提供，柠檬黄[GBW（E）100001a，0.50 mg/mL]、日落黄[GBW（E）100003a，0.50mg/mL]均由中国计量科学研究院提供，亮黄（上海安谱科学仪器有限公司，CFFC-A0783-25G，含量为96.69%），甲基橙（广州化学试剂厂，分析纯，含量为99.31%），碱性橙（上海安谱科学仪器有限公司，CFFC-A0865-25G，含量为99.94%），乙腈（色谱纯，Fisher），水为高纯水，其他试剂均为分析纯。蛤蚧定喘丸为吉林省8家、广东省2家、天津市1家共11家企业在2010～2011年生产的123批样品。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

混合对照品溶液制备：分别精密称取柠檬黄、胭脂红、日落黄、亮黄、酸性红73、甲基橙、金橙Ⅱ、金胺O、赤鲜红、碱性橙对照试剂，加50%乙醇制成每毫升分别含7.5、3、7.5、1、2、2、2、1、3、0.5 μg的混合溶液，摇匀，即得，作为液相色谱分析；另精密称取金胺O对照试剂适量，加甲醇制成每毫升含100 ng的溶液，即得，作为LC-MS/MS确证分析。

供试品溶液的制备：取本品水蜜丸，研细，或大蜜丸剪碎，精密称取约0.8 g，置锥形瓶中，精密加入50%乙醇10 mL，称定重量，超声处理（功率400 W，频率40 kHz）5 min，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

2.2 HPLC检测

2.2.1 色谱条件 色谱柱：CAPCELL PAK MGⅡ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A为乙腈，B为0.01 mol/L乙酸铵溶液（含0.5%冰乙酸），梯度洗脱，0～20 min，A5%，B95%；20～25 min，A5%→50%，B95%→50%；25～30 min，A50%→70%；B50%→30%；30～31 min，A70%→5%，B30%→95%；31～45 min，A5%，B95%；检测波长为420 nm和500 nm。理论板数按金胺O峰计算应不低于150 000。

2.2.2 线性范围的考察 精密称取金胺O 10.95 mg、碱性橙5.97 mg、亮黄11.56 mg、酸性红7322.86 mg、甲基橙20.04 mg、金橙Ⅱ24.99 mg、胭脂红31.25 mg和赤藓红35.68 mg，置同一个100 mL量瓶中，加50%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照试剂贮备液；分别精密量取对照试剂贮备液0.20、0.50、1.00 mL，分别置100 mL量瓶中，另依次精密量取柠檬黄和日落黄各0.30、0.70、1.50 mL，分别置上述100 mL量瓶中，加50%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线1、2、3；分别精密量取对照试剂贮备液0.50、1.00 mL，分别置15 mL量瓶中，另依次精密量取柠檬黄和日落黄各0.75、1.5 mL，分别置上述15 mL量瓶中，加50%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线4、5；精密吸取以上溶液10 μL，注入高效液相色谱仪进行测定，以对照试剂浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。

2.2.3 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，按“2.2.1”的色谱条件，连续测定6次，结果10个对照试剂的峰面积RSD均<1.0%（n = 6），表明仪器的精密度良好。

2.2.4 稳定性实验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，分别于0、2、4、12、27 h，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，结果10个对照试剂的峰面积RSD均<1.5%（n = 5），试验表明，在27 h内，被测物稳定。

2.2.5 重复性实验 取同一供试品（批号：20100601），按“2.1”项下的方法平行测定6份，结果仅检出金胺O，6份含量的平均值为0.91 μg/g，RSD=1.5%，结果表明，本法的重复性较好。

2.2.6 加样回收率实验 精密称取已知含量的蛤蚧定喘丸供试品（仅检出金胺O，含量为0.9051 μg/g）约0.8 g共6份，每份分别精密加入混合对照品溶液10 mL[金胺O、柠檬黄、胭脂红、日落黄、亮黄、酸性红73、甲基橙、金橙Ⅱ、赤藓红、碱性橙加入浓度（μg/mL）依次为0.953、7.49、3.36、7.49、1.12、2.24、1.99、2.49、3.48、0.597]，按“2.1”項下的方法提取、测定，计算加样回收率，结果见表1，符合方法学要求。

2.2.7 定量限 通过逐级稀释各对照品溶液质量浓度，进样测定，确定十种对照试剂的定量限，结果见表1。

2.2.8 样品测定 按“2.2”项下的方法，测定了本品11家企业的123批样品中十种染色物的含量，结果有6家企业46批次疑似检出金胺O，为避免假阳性，采用LC-MS/MS法对疑似检出批次的金胺O进行确证。其他九种染色试剂未检出。

2.3 LC-MS/MS确证

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相：A为乙腈，B为0.01 mol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱：0～4 min，A10%→90%，B90%→10%，4～9 min，A90%，B10%，7～7.5 min，A90%→10%，B10%→90%；平衡时间6 min，流速0.3 mL/min，柱温35℃。

2.3.2 质谱条件 质谱装配电喷雾电离源（ESI），干燥气温度：350℃；雾化器压力：40Psi；干燥气流速：5 L/min，鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：9 L/min，毛细管电压：4000 V；喷嘴电压：500 V；驻留时间：40 ms；检测模式：正离子检测，扫描方式：多反应监测（MRM）。见表2。

2.3.3 检出限 通过逐级稀释对照品溶液质量浓度，进样测定，确定金胺O的检出限为（S/N=3）为0.3 ng/g。

2.3.4 样品测定 对以上在HPLC色谱条件下检出和疑似检出金胺O的样品，分别按上述LC-MS/MS条件检验，结果有5家企业33批样品金胺O的保留时间与金胺O对照品的保留时间一致（±2.5%），且样品中金胺O两对离子对应的色谱峰相对丰度比，在金胺O对照品两对离子对应的色谱峰相对丰度比的最大允许偏差范围内，为阳性；13批样品经LC-MS/MS确证为阴性。

對以上确证检出的33批样品，用HPLC测定含量，结果含量在0.31～14 μg/g之间，检出率为26.8%。见图1～4。

3 讨论

在HPLC方法研究时，发现实验难点在于流动相极性对柠檬黄与日落黄分离的影响，黄柏、黄连中有效成分盐酸小檗碱对酸性橙Ⅱ、金胺O保留时间的干扰。在选用实验所用流动相及洗脱方法后，问题得到有效解决。

实验采用Agilent Optimizer质谱条件优化软件对化合物的碰撞能量及碎裂电压进行自动优化，选择响应较大的m/z 268→147；m/z 268→131为采集离子对，其中m/z 268→147为定量离子。同时还手动对干燥气温度、鞘流气温度、鞘流气流速、毛细管电压、离子喷雾电压等离子源条件进行了优化。

蛤蚧定喘丸处方中药味较多，且以原粉直接入药，引入的金胺O来源于原药材。在检验的123批样品中，有33批样品中检出金胺O，而同企业的某些批次样品却未检出金胺O，表明部分企业药材来源不一，质量参差不齐，应采用相对固定原药材的进货渠道，进行动态管理，同时监管部门应加强对中药材的市场监管，从源头上控制中成药的质量，保证人民的用药安全。

本研究针对可能非法添加色素的制剂，先以HPLC直接测定，出现阳性样品或疑似样品时，用灵敏度高的LC-MS/MS法进行快速确证，保证结果的准确、可靠。本方法为快速测定“染色药材（饮片）”是否用于蛤蚧定喘丸生产提供了可靠依据，也为监管部门提供强有力的技术支持。

[参考文献]

[1] 卢士英，邹明强.食品中常见的非食用色素的危害与检测[J].中国仪器仪表，2009，29（8）：45-50.

[2] 姜国萍，孙萍，朱日然.染色中药添加色素的检测技术研究进展[J].时珍国医国药，2015，26（3）：694-696.

[3] 饶伟文，蒋玲，赵纯玉，等.几种染色掺假中药的化工染料鉴定[J].药物分析杂志，2007，27（1）：1742-1745.

[4] 王建伟，梁炽琼.食品中对位红等禁用染料检测方法的研究及最新进展[J].食品安全导刊，2009，3（7）：40-41.

[5] 马长宏，单作刚，齐家炜.中药染色掺假的研究进展[J].亚太传统医药，2011，7（2）：153-154.

[6] 蒋玲，饶伟文.中药染色掺假的研究进展[J].首都医药，2011，15（16）：16-18.

[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：1157.

[8] 蒋玲，彭飞燕，饶伟文，等.染色黄连中金胺O的检测方法研究[J].中草药，2011，42（7）：1344-1347.

[9] 翟海云，刘振平，余晓，等.高效液相色谱法测定中药中的五种禁用黄色工业染料[J].化学研究与应用，2014，26（1）：135-139.

[10] 朱雪妍，谷立勍，何颂华.高效液相色谱-串联质谱法测定葛根芩连片中染色剂金胺O的方法研究[J].中国药物警戒，2016，13（4）：216-218.

[11] 胡青，孙健，张甦，等.中药中48种非法染色色素的TLC法检测[J].中国医药工业杂志，2015，46（7）：695-700.

[12] 莫连峰，饶伟文，赵纯玉，等.高效液相色谱法测定染色黄芩中金胺的含量[J].中国药业，2007，16（15）：29-30.

[13] 刘育坚，许志刚.真空-超声提取联用高效液相色谱分析黄连中的金胺[J].广州化工，2016，44（2）：96-97，103.

[14] 张舒.HPLC法筛查骨刺片中的金胺O[J].中国药师，2015， 18（1）：172-173.

[15] 赵纯玉，饶伟文，莫连峰，等.蒲黄中金胺O的HPLC测定[J].药物分析杂志，2007，27（12）：1956.

[16] 郑娟，邹耀华.HPLC-PDA法检测蒲黄和黄连中十种非法添加色素[J].中国卫生检验杂志，2011，21（5）：1078-1082.

[17] 肖凌，侯俊杰，聂晶.元胡止痛系列制剂中金胺O的检测[J].药物分析杂志，2012，32（11）：2008-2011.

[18] 陈安珍，李新荣，孙磊，等.UPLC-MS/MS法同时检测跌打丸中的6种非法染色物[J].药物分析杂志，2015，35（8）：1453-1457.

[19] 吴萌，饶伟文.黄连上清丸中金胺O的检测方法研究[J].中国药业，2014，23（2）：33-35.

[20] 凌关庭.食品添加剂手册[M].2版.北京：化学工业出版社，1997：541-546.

（收稿日期：2017-01-15 本文编辑：李亚聪）