郑雅卿 陈东杰 李鸿茹 黄珊珊 陈愉生
【摘要】 目的:应用微量肉汤稀释法(MIC)药敏试验测定耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药率,并分析耐药菌的临床特点。方法:搜集2014年11月-2016年4月本院微生物室从不同病区各种临床标本分离的耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌38株(CRKP),应用微量肉汤稀释法进行替加环素药敏试验,从患者年龄、性别、标本类型、原发病、抗生素使用情况等方面对比,分析临床特点与替加环素耐药的相关性。结果:在38株CRKP中筛选到6耐替加环素耐药菌,耐药率为15.8%。耐药性与患者年龄有关(P<0.05),与性别、标本类型、原发病、抗生素使用情况无关(P>0.05)。结论:耐替加环素的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌已经出现,耐药株多见于老年患者。
【关键词】 肺炎克雷伯菌; 耐碳青霉烯; 替加环素
MIC Antimicrobial Susceptibility Test to Tigecycline and Clinical Analysis of Carbapenem Resistant Klebsiella Pneumoniae/ZHENG Ya-qing,CHEN Dong-jie,LI Hong-ru,et al.//Medical Innovation of China,2017,14(16):028-031
【Abstract】 Objective:To study the drug resistance rate of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae to Tigecycline by using broth Microdilution Method(MIC).Method:From November 2014 to April 2016 ward room microorganisms isolated from different clinical samples by carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae 38 strains (CRKP) were collected in our hospital,the application of micro broth dilution method of Tigecycline susceptibility test,the age and sex of the patients, specimen type, primary disease, antibiotic use and other aspects were compared,the clinical features and add ring correlation resistance were analysed.Result:In 38 strains of CRKP,the resistance to Tigecycline were 6 strains,and the drug resistance rate was about 15.8%.Drug resistance was associated with patient age(P<0.05),there were not associated with gender,specimen type,primary disease,or antibiotic use (P>0.05).Conclusion:The carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae to Tigecycline has been found,and the resistant strains are more common in elderly patients.
【Key words】 Klebsiella pneumoniae; Carbapenem resistant; Tigecycline
First-authors address:Provincial Clinical Medical College of Fujian Medical University,Fuzhou 350000,China
doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2017.16.008
替加環素是新上市的甘氨酰环素类抗生素,是临床治疗耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌(Carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)感染的首选药物[1]。但是对替加环素和碳青酶烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌(Tigecycline resistant Klebsiella pneumoniae,TRKP)感染病例有逐年上升趋势,且该耐药菌在院内传播和爆发的形势越来越严峻[2]。TRKP的出现可能使CRKP感染陷入无药可用的困境,严重威胁CRKP感染患者的预后[3]。因此,临床上监测CRKP的替加环素药敏情况,有助于为临床治疗该耐药菌感染提供重要的理论参考,可为早期有效治疗CRKP提供极为有效的帮助,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 菌株来源 搜集2014年11月-2016年4月本院微生物室从不同病区各种临床标本培养出的耐碳青酶烯类肺炎克雷伯38株。标本类型包括:血液、痰、尿液、伤口分泌物、导管末端、肺泡灌洗液、胆汁、鼻腔分泌物、穿刺液、肝脓肿引流液、腹水、胸水等。标本2 h内送检,采用常规细菌分离培养方法,鉴定细菌,所有菌株均应用法国生物梅里埃公司的VlTEK2-compact全自动细菌分析仪进行细菌鉴定及药敏分析,测定最低抑菌浓度(MIC),质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC700603。
1.2 纳入与排除标准 (1)纳入标准:耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌:根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)2016年版标准(CLSIM100-S26)[4],厄他培南≤18 mm、亚胺培南和美罗培南的抑菌圈直径≤19 mm判断为耐药或VITEK-2药敏显示这三种抗生素中介/耐药,需进行手工法确认。美罗培南、亚胺培南或厄他培南三者中,至少对其中之一耐药的菌株为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌。(2)排除标准:剔除重复标本,剔除药敏实验鉴定为非耐碳青霉烯类,即剔除对除厄他培南、亚胺培南和美罗培南三种之外的一种或多种抗生素耐药或全敏感的菌株。
1.3 主要仪器设备 VlTEK2-compect全自动细菌分析仪(法国生物梅里埃公司),替加环素(Selleck公司),96孔板(Nunc公司),MH肉汤(上海嘉楚生物工程有限公司),VITEK2细菌鉴定卡(法国生物梅里埃公司)。
1.4 方法 微量肉汤稀释法药敏试验具体如下。
1.4.1 菌悬液的制备 (1)菌液培养:取冷冻纸片法保存的待测菌种接种于血平板培养基,置35 ℃温箱静止培养16~18 h;(2)配置标准浓度菌液:取血平板上肉眼可见的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌落1个,溶于3~4 mL麦氏标准管,比浊仪上调整至0.5麦氏浊度,此时细菌浓度相当于(1~2)×108 cfu/mL,制成待测菌液;(3)上样菌液稀释:将待测菌液在步骤(2)所得稀释倍数的基础上用MH肉汤再稀释1000倍,此时菌液浓度为(1~2)×105 cfu/mL即为待测菌悬液。注意:测定麦氏浊度所需菌液应在生物安全柜中无菌取样,剩余菌液还需实验,接种于血平板上检测待测菌纯度。
1.4.2 抗菌药物的制备 抗生素母液配制:参照NCCLS标准上抗菌药物相应的R(抗药)值制备待测抗菌药物(母液浓度要遠远大于R值,至少160倍),取替加环素药粉(有效浓度>99%)12.7 mg,溶于5 mL MH肉汤中,配置成抗生素母液浓度2560 μg/mL,分装于无菌小管置-20 ℃备用。
1.4.3 微量肉汤稀释法MIC操作 (1)将待测抗菌药物用MH肉汤进行10倍稀释;(2)无菌96孔板第2~11列加入灭菌MH肉汤100 μL(一药一板);(3)无菌96孔板第1列加入10倍稀释的药液200 μL,逐次倍比稀释至第11列(每孔液体终体积是100 μL);(4)无菌96孔板的每一孔加入待测菌液100 μL,每孔液体终体积是200 μL(由于整板都是一种药物,所以96孔板的每一行可进行一种细菌的药敏试验,为了保证实验的可靠性,每株菌进行一次重复,即一株菌做两行,一块板可做四株细菌的药敏试验),此时96孔板上抗生素浓度从1到11孔分别是128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/L;(5)无菌96孔板的第12列上4孔加入200 μL/孔灭菌MH肉汤作为阴性对照,第12列下4孔加入200 μL/孔菌液(四株菌的菌液)作为阳性对照;(6)药物和菌液上样完毕后,盖好板盖,置35 ℃温箱培养18~22 h观察结果,结果参照2009年NCCLS抗菌药物敏感性试验解释标准。注意:无菌操作。
1.5 统计学处理 使用SPSS 17.0统计软件进行分析,连续数值变量数据采用(mean±SD)表达,计量资料采用t检验(正态分布)或秩和检验(非正态分布),计数资料采用 字2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 替加环素微量肉汤稀释法药敏结果 38株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯对替加环素的微量肉汤稀释法药敏检测(MIC)结果根据EUTAST标准判断(替加环素MICs≤1 mg/L为敏感,2 mg/L为中介值,替加环素MICs>2 mg/L为耐药),获得6株替加环素耐药的TRKP,耐药率15.79%,这6株对碳青霉烯类抗生素及替加环素均耐药,余32株为非耐药株,对替加环素敏感,对碳青酶烯类抗生素仍耐药;替加环素MICs在1~2 mg/L浓度的敏感菌最多,为25株,占65.79%,见图1。
图1 替加环素微量肉汤稀释法药敏结果
2.2 一般情况 耐替加环素肺炎克雷伯菌组(TRKP组)患者年龄均≥65岁,非耐替加环素组(CRKP组)≥65岁占18.75%,原发病为肺部感染,送检标本为痰的占3例,其中4例在标本送检前有抗生素使用病史,见表1。
3 讨论
因对碳青酶烯类耐药的肺炎克雷伯菌(CRKP)对头孢类、喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类抗生素也显示出高度耐药[5],所以一旦出现碳青酶烯类抗生素耐药,能选择使用的抗生素便十分有限。替加环素于2012年上市,属于甘氨酰环类抗生素,通过与细菌30S核糖体强有力的结合,阻止细菌蛋白质合成而发挥抗菌作用,是耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌治疗的主要药物[6]。替加环素具有抗菌活力强、抗菌谱广、耐药率低的特点,因此被广泛应用于临床对抗重症感染[7]。若CRKP同时又对替加环素耐药,那么可能面临无药可用的危险境地,遗憾的是自2007年第一例替加环素耐药病例被报道以来,这样的菌株不断出现[8-11]。
3.1 耐替加环素肺炎克雷伯菌(TRKP)一般情况分析 本研究得到的6株耐替加环素的耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌均为>65岁的老年患者,标本来源3例为痰,1例为尿,1例为血液,还有1例为肺泡灌洗液;送检标本前有抗生素使用史的有4例;6例中原发病为肺部感染的有3例,均有抗生素使用史。参考P值,认为替加环素耐药与患者年龄有关,与抗生素使用史无关,而林佩贤等[12]认为,肺炎克雷伯菌的替加环素耐药与患者年龄及抗生素使用情况有关。因标本数较少,期待进一步增加例数,分析耐药菌的临床特点和相关危险因素。
3.2 替加环素的药敏结果 本院仪器法测定肺炎克雷伯对碳青酶烯类抗生素耐药时会进行米诺环素和/或替加环素的药敏测定,但是在38株耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)中仪器法仅2例阳性,王辉等[13]认为肺炎克雷伯菌的替加环素仪器法药敏试验不够准确,对替加环素的药敏试验尚无标准化试验操作方法,微量肉汤稀释法MIC是专家共识的推荐方法。本研究利用微量肉汤稀释法测定CRKP对替加环素的耐药性,得到6株耐药株,耐药率为15.79%,接近Roy等[14]试验的耐药率11.2%。与张晓玲等[15]进行的琼脂稀释法试验的耐药率不同,肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药多与外排泵机制有关[16-17]。
针对6株耐药株,如果期待寻找治疗的办法,可以尝试抗生素联合应用或加用外排泵抑制剂或竞争底物。叶荣夏[18]利用磷霉素联合替加环素可以提高MIC50/90的敏感率,赵金云等[19]在药敏试验体系中加入外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP),沈晓强等[20]加入外排泵抑制剂1-(1-萘甲基)哌嗪(NMP),认为都可以提高细菌对替加环素的药物敏感度,但He等[21]认为CCCP无效、NMP有效。这些研究多是体外细菌试验,例数不多,不能很好地体现应用于人体时的治疗效果,对人机体的影响也尚不清楚。所以临床应用还需要进一步探索。目前可行且重要的方法仍是针对致病菌选择合理抗生素使用,减少细菌耐药产生。
综上所述,本研究认为耐替加环素的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌已经出现,耐药株多见于老年患者。
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(收稿日期:2017-05-03) (本文编辑:周亚杰)