脐带间充质干细胞移植治疗难治性系统性红斑狼疮3年随访①

白 茹 戚 燕 吕昭萍 孟明耀 王晋文 侯宗柳

(昆明医科大学第一附属医院风湿免疫科，昆明650032)

脐带间充质干细胞移植治疗难治性系统性红斑狼疮3年随访①

白 茹 戚 燕②吕昭萍 孟明耀③王晋文④侯宗柳③

(昆明医科大学第一附属医院风湿免疫科，昆明650032)

目的：观察脐带间充质干细胞(UC-MSC)治疗系统性红斑狼疮(SLE)前后患者免疫学指标、细胞因子表达量的变化和临床疗效。方法：选择10例SLE患者，在激素、免疫抑制剂治疗基础上，静脉输注培养增殖6代以内的UC-MSC，检测UC-MSC移植治疗SLE前后与其免疫病理相关细胞因子CTLA-4、IL-15、IL-2、CD86、IL-17c、Foxp3、TGFβ2的相对表达量。治疗前后进行SLEDAI评分测定并检测血尿常规、24 h尿蛋白定量、肝肾功能、免疫球蛋白、补体水平。结果：UC-MSC移植治疗后IL-15、IL-2表达量均下降， CTLA-4表达量上升， CD86、IL-17c、Foxp3、TGFβ2表达量的差异无显著性意义；UC-MSC移植治疗后补体C3、C4水平、血清白蛋白量较治疗前升高， 24 h尿蛋白定量、SLEDAI评分较治疗前降低；UC-MSC移植治疗SLE过程中10例移植患者均未出现严重不良反应，无与移植相关并发症。结论：UC-MSC能够调节SLE患者体内参与免疫应答调控的细胞因子的表达量；UC-MSC移植治疗SLE可升高血清白蛋白及补体C3、C4水平，降低24 h尿蛋白量，减轻肾脏损伤，改善患者的临床症状；UC-MSC移植治疗SLE具有良好的安全性；UC-MSC移植可能是一种可行的治疗SLE的方法。

脐带间充质干细胞；移植；系统性红斑狼疮

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种累及多系统、多器官并有多种自身抗体出现的自身免疫性疾病，其基本病理改变是免疫复合物介导的系统性血管炎。SLE患者因正常免疫应答调节机制发生障碍，自身抑制性T细胞功能低下，B细胞多克隆活化和多种自身抗体产生，体液免疫、细胞免疫、补体系统发生异常。目前常用的治疗SLE方法是类固醇激素和免疫抑制药物，抑制免疫系统和缓解因免疫系统攻击正常组织所造成的炎症反应。然而，这些方法都会造成严重的不良反应或并发症，如出现感染、骨髓抑制、骨质疏松、高血压、糖尿病等，而且都只能减缓病情的发展速度，非根治疾病。因此，需要寻找更有效且低毒性的新治疗方法。

脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesen-chymal stem cells,UC-MSC)是从脐带动、静脉间含有的特殊的胚胎黏液样结缔组织—华尔通氏胶(Wharton′s Jelly)中分离得到的具有多能干细胞特性基质细胞，为间充质干细胞中的一种。UC-MSC因其来源丰富，具有多向分化和自身更新能力，使免疫重建、支持造血，诱导免疫耐受及免疫调节作用，而对正常的免疫防御功能则影响甚微，更重要的是UC-MSC基本免疫原性低，即使异体移植也不会发生免疫排斥反应。目前将UC-MSC运用于SLE的治疗已成为风湿病学者的研究新热点，但是移植后的疗效、疗效的持续时间、副反应等方面还需要更多的临床资料的验证。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞来源 UC-MSC来源于本课题组昆明市延安医院中心实验室。实验选用的细胞为培养增殖的6代以内异体UC-MSC，并经过严格的纯化及质控。UC-MSC来源、保存条件均符合国家相关规定及伦理学要求。

1.1.2研究对象 选择2011年至2012年1月昆明医科大学第一附属医院风湿免疫科住院患者5例及昆明市延安医院5例临床诊断为难治性SLE患者是指经过大剂量糖皮质激素[>1 mg/( kg·d)]或/和≥1种细胞毒药物诱导治疗后，在临床和实验室指标上，病情仍持续不缓解甚至恶化者，男性2例，女性8例，年龄22～41岁，平均30.9岁，符合1997年美国风湿病学会(ACR)SLE诊断标准，SLEDAI评分10～31分，平均22.5分。无UC-MSC移植禁忌症。入选标准：①患者符合美国ACR1997年系统性红斑狼疮诊断标准，成人(年龄≥18岁,≤65岁)，性别不限；②病程不限，病情处于活动期SLEDAI评分≥9分；③经过规范的糖皮质激素和免疫抑制剂的治疗半年或以上无效或疗效不好者(患者临床症状、体征无缓解，SLEDAI评分≥9分)；④梅毒、HIV抗体阴性，无静脉药瘾史；⑤无过敏体质、对血液制品或对本实验品不过敏；⑥理解本研究相关步骤，签署知情同意书，能按时前来复查；⑦实验经昆明医科大学第一附属医院及昆明市延安医院伦理委员会审核通过。排除标准：①患者出现无法控制的感染；②处于妊娠期或哺乳期。

1.1.3入选患者UC-MSC治疗前基本情况见表1。

1.1.4UC-MSC治疗前后细胞因子表达量检测标本的采集 10例UC-MSC移植治疗患者，每例经UC-MSC移植治疗5次，每次间隔1月，每次UC-MSC治疗前及治疗后1周的静脉血各5 ml EDTA抗凝管保存。

1.2研究方法

1.2.1UC-MSC移植方法 在进行干细胞移植治疗前，根据患者病情给予糖皮质激素10～80 mg/d及选择使用免疫抑制剂如环磷酰胺、吗替麦考酚酯等治疗；同时经静脉输注培养增殖的6代以内的UC-MSC，每次每公斤体重1×106个细胞，每次输注时间为30～60 min；UC-MSC移植后，若病情得到较好改善，根据患者实际情况泼尼松剂量每2周～1月减少5～10 mg，直至泼尼松每日5～10 mg维持治疗，其他用药无特殊情况均与移植治疗前用药保持一致；据患者病情缓解情况给予3～5次UC-MSC移植治疗。移植术中及术后1周内观察患者有无发热、寒战、皮疹、呼吸困难、胸闷、皮肤瘙痒、静脉炎等不良反应，并对其严重程度进行记录。术后1周、1个月随访，以后每3个月进行随访，共随访36个月。

表1 UC-MSC治疗前患者基本情况

1.2.2实施方法 记录UC-MSC移植治疗前及治疗后1周、1、3、6、12、24及36个月临床症状缓解、实验室指标及SLEDAI评分变化情况。

1.2.3细胞因子 UC-MSC治疗前、治疗1周后细胞因子表达量检测：CTLA-4、IL-15、IL-2、CD86、IL-17c、Foxp3、TGF-β2。

1.3统计学分析 实验资料由SPSS17.0统计软件进行统计分析，根据资料类型采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1UC-MSC移植治疗后临床指标的变化 观察10例患者：肾功能不全4例，经UC-MSC治疗后肌酐均恢复正常；6例浮肿较治疗前明显减轻；5例颜面部红斑、皮疹较治疗前消退；5例血管炎(甲周梗死)消退；4例关节肿痛减轻；1例髋关节痛减轻；9例精神、睡眠较治疗前均有所改善(表2)。

2.2UC-MSC移植治疗后患者实验室检查指标的变化 观察10例患者UC-MSC移植治疗前及治疗后随访1、3、6、12、24、36月临床指标变化，随访结果可看出经UC-MSC移植治疗后患者的补体C3、C4、血清白蛋白水平呈升高趋势，24 h尿蛋白量、SLEDAI评分呈降低趋势(表3)。

2.3治疗后出现的不良反应及处理

2.3.1UC-MSC移植过程中共有4例患者在第2、3次移植治疗后30～60 min内出现发热(体温范围为39～39.9℃)，均无皮疹、皮肤瘙痒等，予口服对乙酰氨基酚混悬液或物理降温后体温可在6 h内降至正常。

2.3.2UC-MSC移植过程中有1例患者在每次输注干细胞均出现头痛、恶心、呕吐，经减慢干细胞输注速度，并予甲氧氯普胺注射液10 mg肌肉注射后上述症状缓解，未发生其他异常情况，该患者共输注UC-MSC 3次。

表2 每例患者UC-MSC治疗前/后临床指标变化

表3 UC-MSC治疗后患者实验室检查指标变化

Note：Matchingttest was performed with SPSS17.0 statistical software .Results showed that P(C3)=0.01,P(C4)= 0.008 ,P(U-pro)=0.01,P(AL-B)=0.001,P(SLEDAI)=0.048,P<0.05,the difference was statistically significant. Serum level of C3,C4 and albumin was increased after treatment of UC-MSC transplantation. Level of urinary protein quantitative for 24 hours and SLEDAI scores was decreased after that.

表4 UC-MSC治疗前后实验室指标变化

表5 UC-MSC治疗前后细胞因子变化

2.3.3经6个月的随访观察未出现与UC-MSC移植相关的其他不良反应及副作用。

2.4UC-MSC移植治疗前后细胞因子变化 统计10例SLE患者进行UC-MSC移植治疗前后IL-15、Foxp3、IL-2、IL-17c表达量较治疗前均下降，CTLA-4、TGF-β2、CD86表达量较治疗前均上升，SPSS17.0统计软件进行配对t检验：P(IL-15)=0.000 1，P<0.001；P(IL-2)=0.019，P<0.05；P(CTLA-4)=0.044，P<0.05，差异有统计学意义，P(Foxp3)=0.362，P(IL-17c)=0.080，P(TGF-β2)=0.182，P(CD86)=0.183，P>0.05，差异均无统计学意义。可见UC-MSC治疗后IL-15、IL-2基因表达量较治疗前降低，CTLA-4基因相对表达量较治疗前升高(表5)。

3 讨论

近年来，间充质干细胞移植治疗SLE尤受关注。UC-MSC可以抑制过度活化的免疫细胞增殖，同时有学者发现SLE患者自体骨髓间充质干细胞存在缺陷[1]，因此自体骨髓间充质干细胞移植显然不是最佳的选择，而异基因UC-MSC移植治疗SLE具有无排斥反应和良好的免疫调节功能而被运用于临床。Yang等[2]的研究提示UC-MSC移植治疗SLE的良好效果。Wang等[3]的研究也提示6月后重复UC-MSC移植治疗的必要性。

本研究结果显示经UC-MSC移植治疗后患者多种临床症状(如结果所示)较治疗前均有所改善，C3和C4水平与SLE疾病活动有关[4]，本研究结果显示UC-MSC治疗后SLE患者补体C3水平较治疗前升高，肾脏表现是SLE最重要的临床表现之一，几乎所有的SLE患者在病程中均可出现肾脏受累，尿蛋白的程度代表肾小球毛细血管襻的受损程度，尿蛋白下降意味着SLE病情好转，本研究结果显示UC-MSC治疗后SLE患者24 h尿蛋白定量较治疗前明显减少、血清白蛋白量较治疗前升高。SLEDAI评分是临床常用的判断SLE病情活动与复发的指标，本研究经 UC-MSC治疗后SLE患者SLEDAI评分较治疗前明显减低。研究结果与Yang[2]及Sun等[5]用UC-MSC治疗SLE结果相似。通过本研究结果表明UC-MSC移植治疗能够改善患者临床症状、体征及实验室检查指标，缓解SLE病情。

本实验中患者出现不良反应及处理如结果2.3所示，既往文献认为原因可能为：①在UC-MSC制备过程中引入的多种外源因子如酶、血清、抗生素、细胞因子、抗体等异种蛋白可能对体温产生影响；②UC-MSC死亡后产生细胞碎片及UC-MSC细胞结团引起发热；③本实验中并非所有患者均出现发热、呕吐，考虑可能与患者自身体质等有关。10例经随访观察未出现与UC-MSC移植治疗相关的严重不良反应及并发症，与Woodworth等[6]研究结果一致，研究结果示UC-MSC治疗SLE具有良好的安全性，与Wang等[7，8]和Sui等[9]用UC-MSC治疗SLE结果一致。

IL-2主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞产生，是所有T细胞亚群的生长因子。IL-2可促进活化B细胞增殖，为调控免疫应答的重要因子，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。IL-15是一种T细胞生长因子，由多种细胞产生，生物学作用与IL-2相似，其细胞来源和靶细胞分布较IL-2广，故可能在不表达IL-2的部位发挥类似IL-2效应，与加重自身免疫性疾病和同种移植的排斥反应有关。本课题研究发现IL-15、IL-2在UC-MSC治疗SLE后表达量均降低，说明IL-15、IL-2降低会缓解SLE患者的病情。Aringer等[10]研究提示活动的SLE中IL-15较健康人群因子量高，与之结果一致。Laza等[11]的研究证实IL-15可提高UC-MSC的治疗，与此研究结果相悖，因此我们需要扩大实验样本例数进一步验证实验结果。

CTLA-4，是一种白细胞分化抗原，是T细胞上的一种跨膜受体，与CD28共同享有B7分子配体，而CTLA-4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。CD28和CTLA-4是2种具有同源性的免疫球蛋白超家族成员，仅在专职抗原递呈细胞表面表达，二者与相同的配体CD86(B7-2)和CD80(B7-1)结合。CD86在树突细胞、巨噬细胞和B细胞表面表达，在这些细胞被激活后表达明显增强；而CD80仅在激活的抗原递呈细胞表面表达，因此二者与免疫应答的启动有关，在T细胞的活化中具有不同的功能，本研究得出UC-MSC治疗SLE后CTLA-4表达量上升，说明提示UC-MSC治疗可通过抑制T细胞的功能治疗SLE。

IL-17c具有促炎症和机体防御机制等功能，具有强大的招募中性粒细胞、促进多种细胞释放炎性因子、促进细胞增殖及抑制部分肿瘤生长等多种生物学作用。Foxp3可以通过与染色体结合后，调节多种基因的表达和功能，进而控制Treg细胞的发育和功能；TGF-β能调节Foxp3表达，从而使CD4+CD25-T细胞分化为Treg，同时参与CD4+CD25+T细胞对排斥反应的抑制。TGF-β还可抑制B细胞及CTL的增殖、分化。CD86与诱导剂CD28相互作用，是诱导T淋巴细胞增殖及产生IL-2的主要协同因子。本实验中IL-17c、Foxp3、TGF-β2、CD86表达量变化均未显示统计学意义，可能与实验样本例数有限或试验方法或更多的其他因素有关，今后还需扩大实验样本例数进一步验证实验结果。

UC-MSC对多种免疫细胞具有调节作用，可以在体内外直接抑制活化的T细胞增殖， 对B细胞增殖及抗体分泌能力均有抑制作用,它可以对NK细胞和B细胞功能产生直接抑制作用,而且它具有与骨髓MSC相似的多向诱导分化潜能，且有更强的增殖能力和生物活性，它分泌多种细胞因子，通过多种途径调节炎性因子的释放，诱导免疫耐受、抑制自身免疫反应，从而发挥治疗作用[12，13]。目前认为UC-MSC的作用机制可能主要通过与免疫细胞(如T淋巴细胞、树突状细胞、淋巴细胞等)直接接触发挥效应，还可通过改变细胞因子分泌网络间接影响多种免疫细胞[14]。

综上所述，UC-MSC通过其分泌功能、对各种免疫细胞的免疫调节作用及其定植分化为受损组织细胞等多方面作用，从SLE发生、发展的多阶段改善病情达到治疗疾病的目的。通过实验结果目前认为UC-MSC治疗SLE是一种安全有效的新方法。细胞因子在调节体液免疫和细胞免疫中有重要作用。UC-MSC通过对SLE患者体内参与免疫应答调控的细胞因子表达量的影响，抑制T淋巴细胞过度增殖、活化，抑制B细胞增殖，上调Treg细胞数量，稳定促炎性细胞因子，恢复SLE患者机体免疫平衡，从而缓解患者临床症状，降低疾病活动性，改善患者血清学指标，达到治疗疾病的目的。

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[收稿2016-09-07 修回2016-11-08]

(编辑 许四平)

3yearsfollow-upofrefractorysystemiclupuserythematosuspatientswithtransplantationtreatingofumbilicalcordmesenchymalstemcells

BAIRu,QIYan,LÜZhao-Ping,MENGMing-Yao,WANGJin-Wen,HOUZong-Liu.DepartmentofRheumatology,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China

Objective:To observe immunological indexes,the quantity of cytokine expression and clinical curative effect of umbilical cord mesenchymal stem cells between before and after the treatment of systemic lupus erythematosus patients.Methods:Selected 10 cases of SLE,on the basis of glucocorticoid and immune inhibitor treatment, intravenous injection UC-MSC of cultivating proliferation within 6 generations.Before and after treatment of UC-MSC testing the relative quantity of cytokine of CTLA-4,IL-15,IL-2,CD86,IL-17c,Foxp3,TGF-β2 which were related of immunopathogenesis of SLE.Before and after treatment to determined SLE disease activity index(SLEDAI) score and detection of blood in the urine routine,liver and kidney function,24 hours urinary protein quantitative,immunoglobulin and complement levels.Results:After treatment the relative expression value of IL-15 and IL-2 was decreased,CTLA-4 was risen.There had no significant difference with the relative expression value of CD86,IL-17c,Foxp3,TGF-β2 in before and after treatment of UC-MSC .After treatment serum complement C3 and C4 level,serum albumin,were risen.24 hour proteinuria and SLEDAI were decreased.There was no serious adverse reaction occurred,no complications related to transplantation in 10 cases.Conclusion:UC-MSC can regulate the expression of cytokines of participate in the immune response in the patients with SLE.Treatment of SLE by UC-MSC can elevate serum albumin and C3 and C4 level,reduce the 24 hours urinary protein quantity,relife kidney damage,improve clinical symptoms;UC-MSC transplantation in patients with SLE have good security;UC-MSC transplantation may be a feasible method for the treatment of SLE.

Umbilical cord mesenchymal stem cells；Transplantation；Systemic lupus erythematosus.

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.020

①本文为云南省科技厅社会发展科技(社会事业发展专项)2010CA004，云南省科技厅对外科技合作项目(国际合作)2013IA013。

②四川省人民医院城东病区内一科，成都610101。

③昆明市延安医院中心实验室，昆明650000。

④昆明市延安医院肾脏内科，昆明650000。

白 茹(1982年-)，女，硕士，住院医师，主要从事干细胞、免疫吸附治疗SLE方面的研究。

及指导教师：侯宗柳(1959年-)，女，研究员，主要从事细胞与免疫调节方面的研究，E-mail：hzl579@163.com。

R593.24

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1000-484X(2017)06-0905-05