雷公藤红素逆转乳腺癌细胞对多柔比星的耐药性及机制研究

孙凯 孙菊萍

雷公藤红素逆转乳腺癌细胞对多柔比星的耐药性及机制研究

孙凯 孙菊萍

目的探讨雷公藤红素逆转乳腺癌细胞对多柔比星的耐药性及作用机制。方法将多柔比星耐药MDA-MB-231细胞（MDA-MB-231/R细胞）分为对照组、雷公藤红素组、多柔比星组、雷公藤红素+多柔比星组和雷公藤红素+多柔比星+Bim siRNA组，MTT法检测MDA-MB-231/R细胞活力，流式细胞术检测各组MDA-MB-231/R细胞的凋亡，免疫共沉淀法检测MDA-MB-231/R细胞Bim蛋白与Bak及Bax蛋白的相互作用，Western blot检测MDA-MB-231/R细胞色素C释放和Caspase-3活化。结果MDA-MB-231/R细胞对多柔比星的半数有效浓度（IC50）显著高于常规MDAMB-231细胞[（18.4±1.1）g/mL比（1.5±0.1）g/mL，P<0.05]；雷公藤红素处理后，多柔比星对MDA-MB-231/R细胞活力抑制率和凋亡诱导率均显著提高，与对照组和多柔比星组比较，差异有统计学意义[（57.3±4.1）%比0、（13.0±1.0）%，（36.5±2.3）%比（1.6±0.2）%、（8.8±0.6）%，P均<0.05]；雷公藤红素处理能显著上调MDA-MB-231/R细胞Bim蛋白表达水平[（0.51±0.04）比（0.11±0.01）、（0.13±0.01），P均<0.05]；用Bim siRNA阻断Bim蛋白上调后，雷公藤红素对多柔比星的协同抗肿瘤效应受到明显抑制[（20.5±2.1）%比（57.3±4.1）%，（12.4±1.1）%比（36.5±2.3）%，P<0.05]；雷公藤红素处理后，与MDA-MB-231/R细胞Bim蛋白结合的Bak、Bax蛋白表达水平显著提高[（0.29±0.02）比（0.04±0.01）、（0.05±0.01），（0.35±0.02）比（0.05±0.01）、（0.04±0.01），P均<0.05）]；雷公藤红素处理后，多柔比星对MDA-MB-231/R细胞色素C的释放率和Caspase-3的活化率显著提高[（0.57±0.05）比（0.11±0.02）、（0.06±0.01），P均<0.05；（0.43±0.04）比（0.09±0.02）、（0.03±0.01），P均<0.05]。结论雷公藤红素可通过上调Bim蛋白表达，提高多柔比星耐药乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性。

乳腺癌；MDA-MB-231细胞；雷公藤红素；多柔比星；Bim；Bak；Bax

乳腺癌是女性高发的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类健康[1]。在乳腺癌的治疗过程中，化疗是不可替代的治疗方法，化疗的疗效在很大程度上决定了乳腺癌患者的预后[2]。多柔比星是一种细胞毒性抗肿瘤抗生素，能抑制肿瘤细胞DNA和RNA的合成，从而诱导细胞凋亡。尽管多柔比星是治疗乳腺癌的重要化疗药物，但该药的重复给药可能造成乳腺癌细胞的获得性药物抵抗，从而降低化疗的治疗效果[3]。因此，通过辅助治疗手段提高乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性，减弱获得性药物抵抗是提高多柔比星疗效有效方法。本研究探讨雷公藤红素逆转乳腺癌细胞对多柔比星的耐药性及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料多柔比星、雷公藤红素、噻唑蓝（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、凋亡检测试剂盒购于美国Sigma-Aldrich。蛋白G免疫共沉淀琼脂糖珠购于美国Santa Cruz。Bim、Bak、Bax、细胞色素C、活化caspase-3和茁-actin抗体购于美国Cell Signaling。ECL试剂盒购于美国Pierce。细胞线粒体分离试剂盒购于江苏碧云天生物科技有限公司。Bim siRNA购于广州锐博生物科技有限公司。Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司。人乳腺癌细胞系MDA-MB-231购于美国ATCC。

1.2 细胞培养人乳腺癌细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养环境为37毅C恒温培养箱中培养并通入5%CO2。多柔比星耐药MDA-MB-231（MDA-MB-231/R）细胞用多柔比星梯度处理法进行诱导构建，简要步骤如下：首先将常规MDA-MB-231细胞用含0.05g/mL多柔比星的培养基培养3个月，之后每3周将多柔比星浓度提高0.01g/mL，最终使MDA-MB-231细胞稳定培养在含0.15g/mL多柔比星的培养基中。进行实验之前，将MDA-MB-231/R在无多柔比星DMEM培养基中先行培养2周以消除残余多柔比星的干扰。

1.3 多柔比星半数有效浓度（IC50）的测定将常规MDA-MB-231或MDA-MB-231/R细胞按5伊103/孔接种于96孔板上孵育过夜，分为常规MDA-MB-231细胞组和MDA-MB-231/R细胞组，将两组细胞用不同浓度的多柔比星处理48h后进行MTT实验并绘制细胞活力-多柔比星浓度曲线，根据曲线计算多柔比星对常规MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231/R细胞的IC50。

1.4 MTT实验将MDA-MB-231/R细胞按5伊103/孔接种于96孔板上孵育过夜，使细胞贴壁。实验分为对照组、雷公藤红素组、多柔比星组、雷公藤红素+多柔比星组及雷公藤红素+多柔比星+Bim siRNA组，每组3孔。对照组为MDA-MB-231/R细胞不加药物培养48h，雷公藤红素组为在MDA-MB-231/R细胞中加入2mol/L的雷公藤红素培养48h，多柔比星组为在MDA-MB-231/R细胞中加入5g/mL多柔比星培养48h，雷公藤红素+多柔比星组为在MDA-MB-231/R细胞中加入2mol/L的雷公藤红素和5g/mL多柔比星培养48h，雷公藤红素+多柔比星+Bim siRNA组为先将50pmol/mL的Bim siRNA用Lipo-fectamine 2000转染入MDA-MB-231/R细胞中培养24h，之后更换DMEM培养基再加入2mol/L的雷公藤红素和5g/mL多柔比星培养48h。药物处理完毕后进行MTT试验，步骤如下：在经过药物处理的MDA-MB-231/R细胞培养体系中加入20滋L 5mg/mL MTT培养4h，弃去上清，孔中加入150滋L二甲亚砜，在570nm波长下用酶标仪检测OD值，细胞活力抑制率计算公式：抑制率=（OD对照组-OD药物处理组）/OD对照组伊100%。

1.5 细胞凋亡实验将MDA-MB-231/R细胞按上述进行分组和药物处理，之后按照凋亡试剂盒说明书步骤将PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入细胞中孵育20min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V阳性细胞数占总细胞数的百分比表示。

1.6 免疫共沉淀将MDA-MB-231/R细胞按上述进行分组和药物处理，之后将细胞用细胞裂解液进行裂解，裂解产物在12 000转/分下离心15min，取上清液，分成等量两份。一份上清液用于检测茁-actin的表达作为对照。另一份上清液在其中加入Bim抗体孵育过夜后加入蛋白G琼脂糖珠孵育2h。将Bim抗体孵育后的产物在1200转/分低速下离心5min，小心吸去上清留取琼脂糖珠。琼脂糖珠用细胞裂解液重悬后进行western blot实验用于检测Bim与Bak及Bax蛋白的相互作用。

1.7 线粒体分离将MDA-MB-231/R细胞按上述进行分组和药物处理，之后用细胞线粒体分离试剂盒分离肿瘤细胞的线粒体，细胞质进行Western blot实验，检测细胞色素C的释放。

1.8 Western blot实验将MDA-MB-231/R细胞按上述进行分组和药物处理，之后将细胞用细胞裂解液进行裂解，裂解产物在12 000转/分下离心15min，提取总蛋白质进行Western blot实验（免疫共沉淀产物或线粒体分离试剂盒分离出的细胞质可直接进行后续实验）。将样品用12.5%SDS-PAGE进行电泳分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上，用Bim、Bak、Bax、细胞色素C、活化Caspase-3和茁-actin抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。蛋白灰度值分析用Image J软件处理，目标蛋白的相对表达水平用它们的蛋白灰度值与茁-actin灰度值的比值表示。

2 结果

2.1 雷公藤红素抑制MDA-MB-231/R细胞对多柔比星的耐药性结果显示,多柔比星对MDA-MB-231/R细胞的半数有效浓度（IC50）显著高于常规MDAMB-231细胞（P<0.05），见表1。联合雷公藤红素处理后，多柔比星对MDA-MB-231/R细胞的活力抑制率和凋亡诱导率都显著提高（P均<0.05），见表2。雷公藤红素处理能显著上调MDA-MB-231/R细胞Bim蛋白的表达水平（P均<0.05），而多柔比星单独处理对Bim无影响。同时，当用Bim siRNA阻断Bim蛋白的上调后，雷公藤红素对多柔比星的协同抗肿瘤效应受到明显抑制（P均<0.05），见表2。

表1 两组细胞对多柔比星IC50比较（）

表1 两组细胞对多柔比星IC50比较（）

注：与常规MDA-MB-231细胞组比较，*P<0.05；IC50：半数有效浓度

组别孔数多柔比星IC50（滋g/mL）常规MDA-MB-231细胞组MDA-MB-231/R细胞组3 3 1.5±0.1 18.4±1.1*

2.2 雷公藤红素促进Bim蛋白与Bak、Bax蛋白的相互作用免疫共沉淀结果显示，经过雷公藤红素处理后，与MDA-MB-231/R细胞Bim蛋白结合的Bak、Bax蛋白水平显著提高（P<0.05），见表3。

表2 雷公藤红素上调Bim蛋白的表达并提高多柔比星对MDA-MB-231/R细胞的抗肿瘤活性（）

表2 雷公藤红素上调Bim蛋白的表达并提高多柔比星对MDA-MB-231/R细胞的抗肿瘤活性（）

注：与对照组比较，*P<0.05；与多柔比星组比较，吟P<0.05；与雷公藤红素+多柔比星组比较，银P<0.05；Bim：Bcl-2蛋白家族细胞死亡调控分子；Bim siRNA：Bim小干扰RNA；茁-actin：茁-肌动蛋白

组别对照组雷公藤红素组多柔比星组雷公藤红素+多柔比星组雷公藤红素+多柔比星+Bim siRNA组孔数雷公藤红素浓度（mmol/L）Bim siRNA浓度（pmol/mL）多柔比星浓度（滋g/mL）3 3 3 3 3 0 2 0 2 2 0 0 0 0 5 0 0 0 5 5 5细胞活力抑制率（%）0 7.3±0.6* 13.0±1.0* 57.3±4.1*吟20.5±2.1银凋亡诱导率（%）1.6±0.2 4.3±0.3* 8.8±0.6* 36.5±2.3*吟12.4±1.1银Bim/茁-actin比值0.11±0.01 0.53±0.04* 0.13±0.01 0.51±0.04*吟0.09±0.01银

表3 雷公藤红素促进Bim蛋白与Bak、Bax蛋白的相互作用（）

表3 雷公藤红素促进Bim蛋白与Bak、Bax蛋白的相互作用（）

注：与对照组比较，*P<0.05；与多柔比星组比较，吟P<0.05；与雷公藤红素+多柔比星组比较，银P<0.05；Bim：Bcl-2蛋白家族细胞死亡调控分子；Bim siRNA：Bim小干扰RNA；茁-actin：茁-肌动蛋白；Bak：Bcl-2拮抗分子；Bax：Bcl-2相关性x促凋亡分子

组别对照组雷公藤红素组多柔比星组雷公藤红素+多柔比星组雷公藤红素+多柔比星+Bim siRNA组孔数雷公藤红素浓度（mmol/L）Bim siRNA浓度（pmol/mL）多柔比星浓度（滋g/mL）3 3 3 3 3 0 2 0 2 2 0 0 0 0 5 0 0 0 5 5 5与Bim结合的Bak/茁-actin比值0.04±0.01 0.27±0.02* 0.05±0.01 0.29±0.02*吟0.06±0.01银与Bim结合的Bax/茁-actin比值0.05±0.01 0.33±0.02* 0.04±0.01 0.35±0.02*吟0.04±0.01银

表4 雷公藤红素联合多柔比星诱导MDA-MB-23/R细胞色素C的释放和Cappase-3的活化（）

表4 雷公藤红素联合多柔比星诱导MDA-MB-23/R细胞色素C的释放和Cappase-3的活化（）

注：与对照组比较，*P<0.05；与多柔比星组比较，吟P<0.05；与雷公藤红素+多柔比星组比较，银P<0.05；Bim：Bcl-2蛋白家族细胞死亡调控分子；Bim siRNA：Bim小干扰RNA；茁-actin：茁-肌动蛋白；Caspase-3：半胱天冬酶-3

组别对照组雷公藤红素组多柔比星组雷公藤红素+多柔比星组雷公藤红素+多柔比星+Bim siRNA组孔数雷公藤红素浓度（mmol/L）Bim siRNA浓度（pmol/mL）多柔比星浓度（滋g/mL）3 3 3 3 3 0 2 0 2 2 0 0 0 0 5 0 0 0 5 5 5细胞质中的细胞色素C/茁-actin比值0.01±0.01 0.06±0.01 0.11±0.02* 0.57±0.05*吟0.16±0.02银活化caspase-3/茁-actin比值0.01±0.01 0.03±0.01 0.09±0.02* 0.43±0.04*吟0.13±0.02银

2.3 雷公藤红素联合多柔比星诱导MDA-MB-231/ R细胞色素C的释放和Caspase-3的活化Western blot结果显示，雷公藤红素联合多柔比星处理后，MDAMB-231/R细胞色素C的释放和Caspase-3的活化显著提高（P均<0.05），见表4。

3 讨论

雷公藤红素是一个具有多种生物活性的天然药物活性成分，来源于中药雷公藤的根皮，具有很强抗氧化、抗风湿作用。近年研究发现雷公藤红素还有较好的抗肿瘤活性，对结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤都有治疗作用[4-5]。然而，雷公藤红素是否对已产生获得性多柔比星耐药的乳腺癌细胞有药物增敏效应，至今还未充分报道。本研究结果表明，已产生获得性多柔比星耐药的乳腺癌细胞对多柔比星高度耐药，然而在使用多柔比星的同时联用雷公藤红素后，多柔比星耐药的乳腺癌细胞发生了显著的凋亡，表明雷公藤红素能提高多柔比星耐药乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性，中药雷公藤红素在多柔比星治疗中是良好的辅助治疗药物。

Bim是一种Bcl-2促凋亡蛋白家族成员，主要分布在线粒体的外膜，参与线粒体膜孔道的调节[6]。文献[7]报道，Bim的表达水平与肿瘤细胞对药物的敏感性高度相关，Bim基因的沉默可导致肿瘤细胞凋亡通路的失敏和药物疗效的下降。本研究证实雷公藤红素能通过上调多柔比星耐药乳腺癌细胞中Bim蛋白的表达而增强多柔比星对该耐药肿瘤细胞的杀伤活性，与文献报道一致。当用小干扰RNA抑制Bim基因的表达后，雷公藤红素的协同抗肿瘤效应明显减弱，表明雷公藤红素发挥作用机制可能和Bim蛋白的上调有关。

线粒体途径的凋亡是多种化疗药物发挥抗肿瘤效应的机制，主要由Bcl-2蛋白家族进行调节[8]。Bim蛋白在肿瘤细胞中能与Bak和Bax蛋白发生相互作用从而使它们活化并导致蛋白构象的变化。在DNA损伤等凋亡信号下，活化的Bak和Bax能在线粒体外膜表面形成通透性外膜孔道，使线粒体中的细胞色素C释放到细胞质中，从而激活Caspase-3使细胞最终发生凋亡性死亡[9-10]。本研究结果表明，雷公藤红素可以通过上调Bim蛋白的表达，促进其与Bak、Bax蛋白的相互作用，使它们发生活化，从而使多柔比星耐药乳腺癌细胞在多柔比星的作用下打开线粒体的通透性膜孔道，释放其中的细胞色素C，最终诱导Caspases依赖的凋亡[11]。

综上所述，雷公藤红素能显著提高耐药乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性。其机制可能是雷公藤红素能通过Bim-Bak/Bax途径，诱导耐药乳腺癌细胞在多柔比星的作用下发生线粒体途径的凋亡。

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（收稿：2016-09-25修回：2016-10-26）

Celastrol Increased the Sensitivity of Doxorubicin-resistant Breast Cancer Cells to Doxorubicin by Upregulating the Expression of Bim

SUN Kai1,SUN Juping2.1 Department of Pathology,2 Clinical Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China

Objective To investigate the role and mechanism of celastrol in reversing the doxorubicin-resistance in breast cancer cells.M ethods The doxorubicin-resistant MDA-MB-231 cells（MDA-MB-231/R cells）were grouped as control group,celastrol group,doxorubicin group,doxorubicin+celastrol group,and doxorubicin+celastrol+Bim siRNA group.Then,the MTT assays were performed to measure the cell viability;Flow cytometry analysis was performed to detect the cell apoptosis;Co-immunoprecipitation analysis was performed to evaluate the interaction of Bim with Bak and Bax;Western blot analysis was performed to evaluate the release of cytochrome c and the activation of caspase-3.Results The IC50 of doxorubicin to MDA-MB-231/R cells was significantly higher than the routine MDA-MB-231 cells（18.4±1.1g/mL vs 1.5±0.1g/mL,P<0.05）.Cell viability inhibitory rate and apoptotic rate of MDA-MB-231/R cells in celastrol+doxorubicin group was significantly higher than that in the control group and the doxorubicin group（57.3%±4.1%vs 0,13.0%±1.0%;36.5%±2.3%vs 1.6%±0.2%,8.8%±0.6%;all P<0.05）.Compared with the control group or the doxorubicin group,treatment with celastrol significantly increased the expression of Bim（0.51±0.04 vs 0.11±0.01,0.13±0.01;P<0.05）and the subsequent interaction of Bim with Bak（0.29±0.02 vs 0.04±0.01,0.05±0.01;P<0.05）and Bax（0.35±0.02 vs 0.05±0.01,0.04±0.01;P<0.05）.Treatment of Bim siRNA significantly inhibited the anti-tumor effect of celastrol+doxorubicin（cell viability inhibitory rate:20.5%±2.1%vs57.3%,±4.1%;apoptotic rate:12.4%±1.1%vs 36.5%±2.3%;all P<0.05）.The release of cytochrome c and activation of caspase-3 in MDA-MB-231/R in the celastrol+doxorubicin group was elevated than those in the doxorubicin group and the celastrol group（cytochrome c:0.57±0.05 vs 0.11±0.02,0.06±0.01;caspase-3:0.43±0.04 vs 0.09±0.02,0.03±0.01;all P<0.05）.Conclusion Celastrol increased the sensitivity of doxorubicin-resistant breast cancer cells to doxorubicin by upregulating the expression of Bim.

breast cancer;MDA-MB-231 cells;celastrol;doxorubicin;Bim;Bak;Bax

浙江中医药大学附属第二医院病理科（孙凯）、检验科（孙菊萍）（杭州310005）

孙凯，Tel：15382362622；E-mail：xinhuasunkai@163.com