皖南花猪链球菌分离鉴定及耐药性研究

吕彩云，王德青，吕 容，孙毅然，范腾飞，王 宁

（黄山学院 生命与环境科学学院，安徽 黄山 245041）

[资源与环境]

皖南花猪链球菌分离鉴定及耐药性研究

吕彩云，王德青，吕 容，孙毅然，范腾飞，王 宁

（黄山学院 生命与环境科学学院，安徽 黄山 245041）

猪链球菌病是一类重要的人畜共患传染病，通过从皖南花猪采集样本，进行猪链球菌分离鉴定，对分离菌株经过不同药物抑菌实验研究，旨在了解地方优良品种猪链球菌对不同药物耐药情况，为地方猪链球菌病防治提供参考，为皖南花猪保种及开发利用奠定坚实基础。

皖南花猪；分离；鉴定；耐药性

皖南花猪是国家级重点保护的 78个地方畜禽品种之一，2001 年 5 月, 被安徽省列入第一批地方畜禽品种保护名录。 由于肉味鲜嫩，营养丰富，一直备受 市 场 青 睐[1]。 近 年 来,由 于 受 外 来 高 产 生猪品种的强烈冲击，皖南花猪等地方品种逐渐被培育品种或杂 交 种所取 代 ，导致皖 南花猪数 量急剧 下 降[2]。 目前 已 有 专 门 机 构 负 责 皖 南 花 猪 保 种 计 划[3]。 但 在 实施保种进程中，细菌性疫病严重危害到皖南花猪生产和繁殖，给保种工作带来很大麻烦。

猪链球菌病属国家规定的二类动物疫病，是一类重要的人畜共患传染病。 1968 年丹麦学者首次报道了3例人感染猪链球菌导致脑膜炎并发败血症病例，截至 2000 年，全球已报道了 200 多例人感染猪链球菌病病例，报道病例较多的国家或地区普遍养殖业发达或有食用猪肉的习惯，病例呈高度散发态势[4]。 在我国 ，1998 年江 苏省 报 告了人 感染猪链 球菌病，发病 25 例，死亡 14 例；2005 年 6-8 月，四川省发生的人感染猪链球菌病爆发疫情，为国内外迄今为止见于报道的最大规模人感染猪链球菌病疫情，发 病数 204 例，死亡 38 例[5]。 在 猪链球 菌疫 病 防治过程中，抗生素成为首选药物，由于抗生素大量使用，导致猪链球菌耐药性日益严重，并呈现一定的区域特征。

为了解皖南花猪链球菌的感染情况及耐药现象，本研究从皖南地区皖南花猪规模化养殖场采集 50个临床样本，进行猪链球菌分离鉴定，通过对分离到的猪链球菌菌株进行不同药物抑菌实验研究，旨在系统了解皖南花猪链球菌对不同药物耐药情况，为皖南花猪保种场及养殖户能及时、准确、有针对性地选用药物，制定科学、系统的防治方案提供科学依据，为皖南花猪保种及开发利用奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

2015 年 7 月份，在无菌条件下，从皖南地区某皖南花猪养殖场采集健康猪群的生长猪、商品猪、母猪、公猪 4 个不同生长阶段猪的鼻拭子，共 50 份样品。 见表1。

表1 采集份数

1.1.2 仪器与试剂

显微镜、离心机、培养箱、-80℃冰箱、无菌操作台等仪器，牛肉粉、胰蛋白胨、葡萄糖、碳氢酸钠、氯化钠、磷酸氢二钠、革兰氏染色液配置试剂等均由黄山学院生命与环境科学学院实验室提供。多粘菌素 B、无菌绵羊血、各类抗生素药敏纸片均购自上海古朵生物科技有限公司，购买的药敏纸片分别有：β内酰胺类的阿莫西林、头孢菌素；氨基糖胺类的庆大霉素、卡那霉素；四环素类的金霉素、土环素；氯霉素类的氯霉素、氟苯尼考；大环内酯类的罗红霉素、红霉素；喹诺酮类的环丙沙星、诺氟沙星；呋喃类药物有呋喃妥因、呋喃唑酮。

1.2 方法

1.2.1 培养基配置

THB 增菌培养液配置（g/L）：牛肉粉 10.0g，胰蛋白胨 20.0g， 葡 萄 糖 2.0g， 碳 酸氢 钠 2.0g， 氯化钠2.0g，磷酸氢二钠 0.4g，pH 值调至 7.8±0.1，温度控制在 25℃。 向其液体培养基中加入 5%无菌绵羊血和0.2%多粘菌素 B，摇匀，分装。

选择性血平板制备： 以 THB 液体培养基为基础, 向其中加入 15%的琼脂，高压蒸汽灭菌 121℃，灭菌 30min，冷却到 55℃左右，向其加入 5%的无菌绵羊血清和 15μg/mL 多粘菌素 B，充分混匀， 倒平板，使其冷却，待用。

1.2.2 病原分离培养

将采集样品首先接种于灭菌的 5mL THB 液体培养基中进行猪链球菌增菌培养，37℃培养 12h 后，分别取 200uL 增菌液划线接种于灭菌的选择性血平板，37℃培养 24h 后，挑取表面呈灰白色、光滑、针尖大小的圆形菌落接种于鲜血琼脂平板纯培养。

1.2.3 镜检

挑取可疑的菌落分别进行涂片，革兰氏染色，染色过程为结晶紫浸染 1-2min，碘液媒染 2min，酒精脱色 30s，石炭酸番红复染 30s，最后镜检观察。

1.2.4 生化鉴定

将经过分离纯化的疑似菌落利用蔗糖、葡萄糖等糖发酵实验以及硫化氢等生理生化实验进行鉴定。

1.2.5 药敏试验

对鉴定为阳性的分离纯化菌分别采用 K-B 纸片 扩 散 法[4]进 行 药 敏 试 验 ， 首 先 挑 取 单 个 菌 落 均 匀密集的涂布在整个平板上，将含有不同药物的药敏纸片用烧灼灭菌的镊子分别贴于平板表面，进行药敏试验。同时设置对照，每个药敏纸片相距 24mm,且与边缘距离不小于 14mm， 盖上平板封口， 恒温箱37℃，18h 培养，测定抑菌圈大小。

2 结 果

2.1 病原分离纯化鉴定结果

将从皖南地区养殖场采集到的 50份皖南花猪鼻拭子样品，分别经过 THB 液体培养基增菌培养，选择性血平板分离纯化培养，挑取菌落形态呈饱满圆润、表面光滑湿润、边缘整齐、半透明的疑似菌落。 经革兰氏染色呈蓝色，单个，或呈少量的 3-5 个排列的短链球菌。 最后将经葡萄糖、蔗糖等生理生化实验鉴定符合猪链球菌生化培养特性，鉴定为猪链球菌，镜检结果见图 1。 结果分离到 14 株猪链球菌，分离率达到 28%。

图1 猪链球菌株革兰氏染色镜检

2.2 药敏试验结果

将分离鉴定的 14株猪链球菌分别进行 β 内酰胺类等 7 类 12 种药物的药敏试验，同时设置对照，药敏试验结果见表2。

表2 猪链球菌分离株的药敏试验表

3 讨 论

皖南花猪是我国地方优良种猪之一，随着外来种猪的影响，现有种群数量少，优良基因流失。 许多疫病严重影响到地方品种猪的生产性能，如猪链球菌病，它是一种人畜共患的急性、热性传染病，临床可能导致哺乳仔猪下痢和孕猪流产等症状，严重可致生猪死亡，因此，做好猪链球菌病的防治工作对皖南花猪保种工作具有非常重要的意义。

本研究在分离猪链球菌时，考虑到样本是在大外环境下从猪鼻腔分泌液中采集，样本中的细菌种类和数量较多，按照常规的培养分离方法纯化到所需要的细菌较难， 根据罗隆泽等人 2007 年文献报道[6]，多 黏 菌素 B 对猪 链 球 菌 没 有 任 何 抑 制 作 用 ，而对大肠杆菌、绿脓杆菌等常见标本菌具有很好的抑制效果。 因此，本实验选用多黏菌素 B制备的选择性血平板培养基通过平板划线方法排除样本中的革兰氏阴性菌，经革兰氏染色镜检观察进一步分离纯化，再结合生理生化实验鉴定符合要求的猪链球菌。 从实验结果来看，整个分离纯化效果比较理想，50 份猪鼻拭子分离到 14 株猪链球菌， 分离率达到28%。

为了较全面系统的了解对皖南花猪链球菌敏感的药物， 本研究选用 β内酰胺类的阿莫西林、头孢菌素，氨基糖胺类的庆大霉素、卡那霉素等 7 大类 14 种抗菌药物进行药敏试验，从试验结果看，从皖南花猪分离到的猪链球菌对 β-内酰胺类抗生素高度敏感；氯霉素类抗生素、氨基糖苷类抗生素以及呋喃类抗生素较为敏感；喹诺酮类药物、四环素类抗生素及大环类酯类抗生素不敏感，有较明显的耐药现象。 因此，在猪链球菌病的防治过程中，建议不定期进行药敏试验，结合药敏结果，科学指导用药；在饲养管理过程中，尽量避免长期使用同一种药物，也可以用不同药物交替使用或几种药物联合使用，对减少猪链球菌病的发病率和死亡率以及皖南花猪的保种工作非常有利。

皖南花猪链球菌病防治坚持以预防为主，不管是规模化的保种场，还是农村的散养户，都要注意搞好卫生，管理好饲料，保证猪群的营养，保持良好的通风和适宜的温度、湿度；要定期消毒，交替使用消毒药；控制人员和物品的流动，同时做好其他疫病的防治工作。

[1]李小金，钱坤，刘林清，等.皖南花猪与大约克猪胴体及肉质性状比较研究[J].养猪，2015（6）：77-80.

[2]王德青，唐鑫生，黄松，等.皖南花猪种质资源保护现状与开发利用对策[J].现代农业科技，2013，（11）：294-297.

[3]洪云华.皖南花 猪资源现状 及存在问题 与 对 策[J].安徽农学通报，2010，16（9）：191-193.

[4]Yu H，Jing H，Chen Z，etal.Human Streptococcus suis out-break,Sichuan，China[J].Emerg Infect Dis，2006,12（6）：914-920.

[5]Hui AC，Ng KC，Tong P Y，et al.Becterial meningitis in HongKong：10-years’experience[J].Clin Neurol Neurosurg，2005，107（5）：366-370.

[6]罗隆泽，李燕春，郭宗 琪 ，等.猪链球菌 选 择性培养 基 研究[J].预防医学情报杂志，2007，23（5）：511-514.

责任编辑：胡德明

The Isolation,Identification and Drug Resistances of Streptococcus suis from the Pig in Southern Anhui

Lv Caiyun,Wang Deqing,Lv Rong,Sun Yiran,Fan Tengfei,Wang Ning
（School of Life and Environmental Sciences,Huangshan University,Huangshan 245041,China）

Streptococcus suis is a common infectious disease in human and swine.This experiment, taking samples from pigs in Southern Anhui,isolates and identifies the pathogenic bacteria,and then conducts drug sensitive experiments on the bacteria in order to understand the drug resistance of streptococcus against different antibiotics.This experiment provides reference for the prevention and control of Streptococcus suis,and lays a solid foundation for the conservation and utilization of the pig in Southern Anhui.

the pig in Southern Anhui;isolation;identification;drug resistance

S828.8

：A

：1672-447X（2017）03-0050-03

2016-12-27

安徽省教育厅自然科学研究项目（KJHS2017B15）；黄山市科技局计划项目（2015Z-01）

吕彩云（1978-），甘肃天水人，硕士，黄山学院生命与环境科学学院教师，研究方向为动物病原分子及微生物学。