乳酸菌对豆粕发酵中特定菌群与多肽水平的影响

陈 曦,李英英，宋铁英

(福建省农业科学院生物技术研究所，福建，福州 350003)



乳酸菌对豆粕发酵中特定菌群与多肽水平的影响

陈 曦,李英英，宋铁英

(福建省农业科学院生物技术研究所，福建，福州 350003)

微生物发酵是改善豆粕营养成分的有效手段，但发酵进程中微生物水平的变化和相关影响尚缺乏足够研究。通过添加外源乳酸菌(屎肠球菌)，研究豆粕72 h发酵进程内，菌群和蛋白水平的变化情况。结果显示，无论是否添加外源乳酸菌，豆粕中的总菌水平均呈三段式下降。相反，豆粕中的乳酸菌水平成增长趋势，且外源添加对这一趋势具有明显的提速(时间缩短1倍)和增效(1.3倍)作用。在蛋白水平的变化上，上述两组豆粕在粗蛋白和游离氨基酸的时间变化趋势上未有明显差别，但在多肽水平的变化趋势上差别显著。添加乳酸菌组豆粕发酵生成的多肽含量更高，且生成的速度更快(时间缩短1倍)，此趋势与豆粕中乳酸菌的增长趋势相对应，表明乳酸菌的添加促进了豆粕中蛋白水解为多肽，但水解不足以产生大量游离氨基酸。

乳酸菌；豆粕发酵；菌群水平；多肽；氨基酸

豆粕指以大豆为原料，提取油脂后的碎片状或粗粉状副产品[1]。豆粕中必需氨基酸含量较高、蛋白成分组成合理、平衡，是鱼类和单胃动物很好的植物性蛋白源[2]。但大豆蛋白质分子结构复杂，相对分子质量高，大豆蛋白消化率和生物效价不高，并且蛋白溶解度较低，无法直接作为功能性成分在食品和饲料中加以利用[3]。添加微生物对豆粕进行发酵，从而产生相应的大豆多肽，被证实是解决上述问题的有效手段[4]。在动物饲养试验上的大量研究表明，多肽的吸收比蛋白质及游离氨基酸更快、更多[5]，并可促进对矿物质等营养物质的吸收[6]，提高机体免疫力，因此具有十分广阔的开发利用前景[7]。然而，目前对于微生物豆粕发酵的研究多集中在抗营养因子去除和发酵后的营养水平方面，对于豆粕发酵中微生物的总菌和特征菌群的数量变化，及微生物对多肽水平的影响，目前尚未完全明确。

本实验室在前期研究中，已经构建了饲料添加类益生菌的菌种库，其中以屎肠球菌(EnterococcusFaecium)为代表的乳酸菌，被证实对于猪的肠道微生态和生长性能具有正向调节作用。本研究以此为基础，通过在豆粕中添加该株乳酸菌进行半固体发酵，探讨外源乳酸菌在发酵进程中，对于豆粕原有微生物总体数量及乳酸菌数量的影响，并与豆粕主要营养成分的改变情况进行关联，为进一步研究微生物在豆粕发酵中的机理机制打下基础。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究豆粕中添加的屎肠球菌(EnterococcusFaecium)菌株来自本实验室，试验时添加的活菌浓度为7×108CFU/ml。所使用的豆粕购于福建省华龙饲料有限公司，粗蛋白质质量分数为41.6%，水分为6.3%。

1.2 发酵参数

试验采用单因素水平处理，以时间(0～72 h)为梯度变量，每12 h为一个梯度，分别设置试验组(添加屎肠球菌)和对照组(不添加屎肠球菌)，豆粕、水和菌液按照1∶ 0.9∶ 0.1的比例混合均匀后，于密封袋中37℃下恒温厌氧发酵。

1.3 指标测定

通过16S 细菌rDNA 实时荧光PCR法，测定豆粕中总菌和乳酸菌的数量变化。每份样品取0.1 g，按照细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)说明书提供的方法提取DNA，荧光定量PCR所用SYBR Premix Ex Taq(Tli RnaseH Plus)按试剂盒(大连宝生物工程有限公司)说明书进行；所用特异引物设计按参考文献[8,9]所述设计(见表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。测得3个重复的数据后进行平均。

豆粕成分变化主要测定水分、粗蛋白质、游离氨基酸和多肽。水分和粗蛋白质含量按参考文献[10]中方法测定；游离氨基酸和多肽含量按参考文献[11]中方法测定。

表1 所用引物序列与扩增片段长度

2 结果和分析

2.1 豆粕发酵进程中微生物变化情况

如图1所示，两组发酵豆粕在初始总菌水平上极为接近，豆粕中总菌水平随着时间变化呈下降趋势，并可分为3个阶段，即在0～24 h内显著降低，24～60 h内的缓慢波动和60 h后的再次降低(图1a)。相反，两组豆粕中乳酸菌水平随时间呈现整体上升态势，其中试验组和对照组略有不同：实验组呈0～24 h内的显著上升，24～48 h内的缓慢上升和48 h后的缓慢下降的三段式波动(图1b),而对照组的乳酸菌水平呈0～48 h内显著上升和48～72 h的缓慢上升的两段式增长。

图1 两组发酵豆粕中总菌和乳酸菌随发酵时间变化情况

2.2 豆粕发酵中主要成分和营养物质随时间变化规律

2.2.1 发酵豆粕水分和粗蛋白质变化情况

从图2中可以看出，无论是实验组还是对照组，在72 h豆粕发酵过程中，其中的水分见图2a，总的粗蛋白质含量见图2b，均并无明显改变。

2.2.2 发酵豆粕中游离氨基酸和多肽随时间变化情况

如图3所示，两组豆粕在发酵过程中，游离氨基酸含量见图3a，随时间变化有小幅波动，幅度分别仅为0.16%(试验组)和0.13%(对照组)，差异并不显著。相反，两组豆粕在发酵中的多肽含量(图3b)出现了显著变化，其中，试验组多肽含量呈现持续上升的状况，其中,0～12 h为波动期，在12～36 h呈现显著上升，36～72 h呈现平缓上升，于72 h达到最高值(1.5%)，此峰值为初始(0.5%)的3倍。对照组的趋势略有不同：于0～48 h呈现波动，于48～72 h显著上升，未出现平缓上升的趋势，峰值水平同样位于72 h(1.4%)，为初始含量(0.54%)的2.6倍。

3 讨论

研究表明，豆粕发酵不仅能降低豆粕的抗营养因子，更重要的是能够通过有益微生物及其产物，改善豆粕的适口性，提高营养品质，辅助提高肠道免疫力[3]。因此，豆粕中微生物的变化情况，直接关系着豆粕的饲料效率和营养价值[12]。从本研究的结果中可以看出(图1)，随着时间变化，发酵豆粕中的总菌数量呈现下降趋势，两组豆粕总菌水平在0～24 h(特别是12～24 h区段)内出现显著下降，极有可能与厌氧环境逐渐形成，占菌群优势比例的好氧菌大量减少有关，因此半固体发酵时豆粕内部形成的厌氧环境，可抑制某些微生物的长期生长。在添加了外源乳酸菌后，试验组在该阶段内乳酸菌大量增长进而成为优势菌群，弥补了上述情况，使得试验组的总菌水平相对较高(图1a)。

与总菌不同，两组豆粕中的乳酸菌在增长趋势上相似，但在增长速度上明显不同(图1b)。对照组乳酸菌水平，在0～48 h内呈现指数增长，之后虽进入平缓期，但未在试验期内出现下降，说明对照组豆粕内环境的乳酸菌容量尚未达到饱和值。与对照组相比，试验组乳酸菌的增长速度明显更快，其在(0～24 h)内即完成指数增长，并在48 h后出现了水平下降，说明此豆粕内环境的乳酸菌含量已达饱和。该峰值水平为5.1×109CFU/g，高于先期的类似报道[13,14]。此外，试验组乳酸菌的峰值水平，较发酵初期增加了40倍，高于对照组的30倍。上述结果说明，外源添加对于豆粕发酵中乳酸菌活菌的生长，不仅具有增速(时间缩短1倍)作用，也具有增效(1.3倍)作用。

在蛋白质成分方面，本试验结果显示，无论是自身的微生物还是外源添加的乳酸菌，均未对豆粕的粗蛋白质和水分水平产生明显影响。该结果说明在封闭的厌氧环境下，豆粕自有微生物群落和外源乳酸菌及其产物，均无法将蛋白质转化为糖分、脂类等其他物质，发酵反应更多的可能是对大分子蛋白质进行降解。

多肽的含量变化情况证实了上述推论。在本试验中，两组豆粕在游离氨基酸含量变化上相差不大，该结果与前人研究[15,16]相符，但多肽的含量则分别提高了3倍(试验组)和2.6倍(对照组)，说明在豆粕发酵中，乳酸菌和豆粕自身菌群主要通过将蛋白质水解为小分子多肽而改变蛋白成分结构，而且外源添加对这种水解有促进作用(3倍与2.6倍)，但水解的程度不深，未足以大量产生游离氨基酸。另外，需要指出的是，试验组的多肽水平在0～36 h后已接近峰值(图3b),快于对照组达到峰值所需的72 h。两组豆粕上述多肽水平的变化趋势均与相应乳酸菌水平的变化(图1b)相符合。上述结果说明无论是否添加外源菌种，豆粕中的乳酸菌均有助于蛋白质水解生成多肽，而添加外源乳酸菌除对多肽在生成水平上有促进外，最为主要的是增速作用(时间缩短1倍)。

4 结论

在72 h的发酵过程中，豆粕发酵所产生的厌氧环境可抑制某些微生物的长期生长，从而造成总菌水平的下降和乳酸菌水平的增长。添加外源乳酸菌对于总菌的下降有弥补作用，而对于乳酸菌的增长有明显的增速和增效作用。两组豆粕在水分、粗蛋白质、游离氨基酸等水平的波动上均未有明显差异，但多肽的含量却明显上升，且添加外源乳酸菌对于多肽的产生也具有增效和显著的增速作用，并在变化趋势上与乳酸菌的增长情况相对应。此结果说明，乳酸菌有助于豆粕蛋白水解生成多肽，但水解不足以产生大量游离氨基酸。

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(责任编辑：舒莲梅)

我国将以科技创新推进“中国好粮油”行动

作为农业供给侧结构性改革的重要内容，我国将大力推广普及粮食科技，推进优质粮油基地建设，加快粮油产品提质升级，以“中国好粮油”行动引导粮油健康消费。

由国家粮食局、中国科协、食品药品监管总局、全国妇联共同举办的2017年粮食科技活动周21日拉开帷幕。以“发展粮油科技、增加优质产品、保障主食安全”为主题，此次活动期间将按“好种子、好原料、好储藏、好加工、好产品、好主食”的粮食产业链条，在安徽、河南、江苏、湖南、广东等地举办系列活动。全国还将开展“中国好粮油”科普进校园、进企业、进军营，把生产和消费优质粮油理念传递给广大生产者、经营者和消费者，以进一步凝聚共识，推动粮油消费提档升级。

(XHS,2017-05-22)

Influence on the level of bacteria amount and polypeptides by the lactic acid bacteria in soybean meal fermentation

CHEN Xi,LI Ying-ying,SONG Tie-ying

(Biotechnology Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003,China)

Although fermentation was one of the best ways to improve the nutrition of the soybean meal,the change of the bacteria and their influences on the fermentation process were inadequately clarified.The soybean meal was investigated on the level of the bacteria and the protein during the fermentation in 72 h with/without the addition of the lactic acid (LAB)EnterococcusFaecium.The results showed that the total bacteria account decreased in 3-step style,no matter whether the LAB was added or not.In contrast，the level of LAB in soybean meal increased during the fermentation,and was strengthened at rate by 100% and at amount by 130% through the addition of extra LAB.With the respect of the protein level,two groups of soybean meal had no significant differences at the changes of crude protein and free amino acid,but were quite different at the changes of polypeptides.The production of the polypeptides in the group with extra LAB were shown to be more efficient at both of the level and rate (by 100%).These changes of the polypeptides were similar to the LAB changing in two groups,indicating that the production of polypeptides but not the free amino acid was improved by the addition of extra LAB.

lactic acid bacteria;soybean meal fermentation;bacteria amount;polypeptides

2017-04-20；

2017-04-28

福建省科技计划项目-省属公益类科研院所基本科研专项(2015R1019-9、2017R1019-2、2017R1019-7)；福州市科技计划项目(2014-N-106)；福建省农业科学院青年创新人才基金项目(2014CX-11)。

陈 曦(1982-)，男，助理研究员，主要从事动物营养和免疫研究。

宋铁英(1963-)，女，研究员，主要从事动物营养和免疫研究。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.06.012

S816.43+1;S816.6

A

1003-6202(2017)06-0046-04