β磷酸三钙/胶原对骨髓间充质干细胞成骨活性的研究①

丁 义,赵 刚

(佳木斯大学附属第二医院正畸科，黑龙江 佳木斯 154000)

β磷酸三钙/胶原对骨髓间充质干细胞成骨活性的研究①

丁 义,赵 刚

(佳木斯大学附属第二医院正畸科，黑龙江 佳木斯 154000)

目的：研究β磷酸三钙/胶原支架对骨髓间充质干细胞成骨活性的影响。方法：支架材料与骨髓间充质干细胞复合培养，作为实验组。7、14、21d分别进行MTS、ALP检测，与无支架材料的对照组进行比较。结果：实验组与对照组细胞数量都逐步增加，实验组数量稍多于对照组，但两组差异无统计学意义(P>0.05)；两组ALP活性都有所增强，且实验组较对照组显著增加，具有统计学意义(P<0.05)。结论：支架材料在体外环境对细胞增殖无不利影响，且能提高骨髓间充质干细胞成骨活性。

支架材料；骨髓间充质干细胞；成骨

β磷酸三钙/胶原复合物的是一种较理想的骨质缺损修复重建材料。EijiK[1]利用该材料充填直径5mm的大鼠颅骨并获得了理想的修复效果，展示了复合物支架的良好的生物相容性。骨髓间充质干细胞，在适宜的诱导条件下可定向分化为多种细胞，其中包括成骨细胞，在创伤部位植入骨髓间充质干细胞与支架材料的复合物，被认为是现今最好的修复骨缺损的方法之一[2]。β磷酸三钙/胶原复合支架的体外研究相对较少，可能与体外实验中培养液的浸泡使材料的物理状态改变有关。本文通过骨髓间充质干细胞与支架材料复合的体外实验，探究支架材料对骨髓间充质干细胞的影响。

1 材料

1.1 主要材料

4～6周龄小鼠，佳木斯大学动物实验中心提供。DMEM培养基(HyClone)，胎牛血清(HyClone)，地塞米松、β一甘油磷酸钠、维生素C(均为Gibco公司)，胰蛋白酶(HyClone)，MTS试剂盒(Boster博士德生物)，碱性磷酸酶试剂盒(购自南京建成)。β磷酸三钙/胶原复合支架购自暨南大学生物医学工程研究所。

1.2 主要仪器设备

CO2恒温细胞培养箱(美国ThermoForma)，超净工作台(苏州明泰空气净化技术有限公司)，电子分析天平(Ohaus，美国)，倒置相差显微镜(Olympus，日本)，酶标仪(Takara，日本)。

2 方法

2.1 骨髓间充质干细胞的分离与培养

无菌条件下分离出小鼠的股骨，剪去两侧骺端，显露髓腔，用1mL注射器吸取培养液(10%胎牛血清，1%双抗，1%谷氨酰胺，88%L-DMEM)冲洗髓腔，直到骨面发白。将细胞转移到15mL离心管中，1500r/min离心10min，弃掉上清液，加入培养液5mL，混匀后接种于培养瓶，置于37℃、CO2体积分数5%的培养箱内培养，48h后换液，去除悬浮未贴壁的细胞，以后每2天更换培养液。细胞达到80%融合以上时，加入0.25%的胰蛋白酶进行消化，按1:2比例传代。

2.2 细胞接种

将材料切割成5mm×5mm×2mm小长方体，紫外线照射消毒灭菌30min；使用培养液5mL浸泡支架10min，倾倒出培养液，重复3次。将5×104个骨髓间充质干细胞与支架材料复合培养于24孔板，对照组不含支架材料，实验组与对照组均添加成骨诱导液(0.1μmol/L地塞米松、50μg/mL维生素C、10mmol/Lβ—甘油磷酸钠)。放入37℃、CO2体积分数5%的培养箱，48h换液一次。

2.3MTS法检测细胞增殖

在分别培养7、14、21d后，弃掉材料和培养基。实验组和对照组每孔均加入60μLMTS液，在培养箱中孵育4h后弃上清，每孔加入600μLDMSO液，轻轻吹打使溶液均匀并按每孔150μL将溶液转移至96孔板中，利用分光光度计在波长为492nm测出吸光度值。

2.4 碱性磷酸酶活性(ALP)测定

在培养7、14、21d后按照ALP试剂盒操作进行检测。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1MTS检测细胞增殖

由表1可见，随着时间增加，两组细胞数量都增加，且实验组数量稍多于对照组，但与对照组相比无统计学差异(P>0.05),说明支架材料未影响细胞正常增殖，可能有利于细胞增殖。

表1 支架材料对BMSCs增殖的影响

3.2 碱性磷酸酶活性测定

由表2可见，随着时间增加，两组碱性磷酸酶活性都增加，且实验组较对照组增加的明显更多，第7天组测量值具有统计学意义(P<0.05)，实验组碱性磷酸酶活性在第14天与第21天较对照组增加显著，且具有统计学意义(P<0.01)。说明β磷酸三钙/胶原支架材料对骨髓间充质干细胞的成骨活性促进作用较显著。

表2 支架材料对碱性磷酸酶活性的影响±s，n=24)

4 讨论

口腔正畸中的牙齿移动一方面来源于牙骨质本身在压力环境中能保持不吸收，维护了牙齿的结构完整，一方面则是牙槽骨受压后吸收并在张力侧迅速增生重建，维护了牙齿移动后的位置不变，所以骨组织工程的进展一直是正畸医生关注的。组织工程中，常使用三维支架支撑缺损部位，随着支架的降解新生组织获得再生的空间同时修复的潜能得以激发[3]。生物活性陶瓷中的磷酸三钙具有生物活性和骨传导作用, 但存在成形不理想、强度低、韧性差等缺点[4]。骨胶原常作为黏合剂与具备骨传导能力的载体如磷酸三钙合用[5]，使其与人骨接近，可提高骨修复效果。骨髓中的间充质干细胞具有取材方便，体外分离培养较容易，且自体获取回输后免疫排斥反应较小以及不受伦理限制等优点，被认为是组织工程的重要种子细胞[6,7]负载骨髓间充质干细胞制备成复合人工骨材料，使支架材料既具有骨传导作用，又具有骨诱导作用[8]。近年来围绕骨髓间充质干细胞的研究越来越多[9,10]。

国内近几年关于磷酸三钙/胶原支架的研究集中于体内研究。本实验在体外环境中评估支架材料对干细胞的影响，实验组与对照组细胞数量随时间均有所增加，而且实验组的数量较对照组稍大，但两组间各时间段细胞数量无统计学差异(P>0.05),提示支架材料的应用并不会影响细胞的正常增殖而可能有利于其生长。在ALP活性方面，实验组和对照组均有增加，且实验组测量值均大于对照组，在第7天组两组测量值存在统计学差异(P<0.05)，第14天组和第21天组实验组测量值显著大于对照组，具有统计学差异(P<0.01)，表明β磷酸三钙/胶原支架材料的存在对骨髓间充质干细胞成骨有明确的促进作用。需要注意的是，在实验过程中，个别组中支架材料变软、结构变得松散。一方面考虑其本身成分可降解，且在体内实验中随着新生组织的修复而被吸收，变软及松散是不断降解的正常现象；一方面考虑在换液操作过程中，反复的液体冲击可能造成材料受力断裂变形。国外的研究侧重于细胞-支架系统机械性能改变的基础研究，证实了复合物弹性模量的改变确实存在，对复合物进入人体后强度的改变具有指导作用，目前尚没有更多关于支架机械性能改进的研究结果。总之，由单一组分的支架材料到多成分的配伍，由支架材料自身到负载细胞、基因的新组合，发展迅速的组织工程为骨缺损修复提供了很大的空间；体内体外实验均对材料的检验有重要的意义，相辅相成，全面认识材料必须是在多方面实验的基础上开始的。目前，仍需要积极的临床试验来确定疗效以及长期效果。

[1]EijiK,JefferyL,KaoruS,etal.Biodegradationpropertyofbeta-tricalciumphosphate-collagencompositeinaccordancewithboneformation:acomparativestudywithBio-OssCollageninaratcritical-sizedefectmodel[J].ClinImplantDentRelatRes, 2014, 16(2):202-211

[2]李焕萍, 刘春蓉, 张永亮. 骨髓间充质干细胞在医学领域中的研究与应用[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11(28):5622-5625

[3]陈欣, 张春林. 组织工程骨修复骨缺损的研究进展及临床应用[J]. 中国组织工程研究, 2010, 14(24):4486-4490

[4]陈美雄. 复合材料人工骨在骨缺损修复中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2007, 11(48):9797-9800

[5]郭宜姣, 李文华. 骨缺损修复生物工程研究进展[J]. 中国骨质疏松杂志, 2014(08):988-993

[6]KruytMC,DhertWJA,OnerFC,etal.Analysisofectopicandorthotopicboneformationincell-basedtissue-engineeredconstructsingoats[J].Biomaterials, 2007, 28(10):1798-805

[7]DePeppoGM,SjovallP,LennersM,etal.Osteogenicpotentialofhumanmesenchymalstemcellsandhumanembryonicstemcell-derivedmesodermalprogenitors:atissueengineeringperspective[J].TissueEngPartA，2010，16(11):3413-3426

[8]张志宏, 刘志礼, 高志增,等. 骨修复替代材料修复骨缺损的选择与应用[J]. 中国组织工程研究, 2012(52):9836-9843

[9]张立超, 贺涛, 帅逸,等. 正常大鼠的骨髓间充质干细胞对去势大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化的影响[J]. 黑龙江医药科学, 2016, 39(2):93-95

[10]赵力, 张雪松, 刘程伟,等.PDGF-B基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究[J]. 黑龙江医药科学, 2005, 28(6):16-17

Effect of theβ-TCP/Col composite to BMSCs in bone formation activity

DINGYi,ZHAOGang

(Orthodontic Department, The Second Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154002,China)

Objective：Purpose study effect of theβ-TCP/Col composite to BMSCs in bone formation activity. Methods: The BMSCs were cultured with materials as experimental group while the control group with no materials. Tests were taken about MTS, ALP on the 7th, 14th and 21th day. The two groups were compared. Results：Cell numbers and ALPs increased in both groups while there’s no difference in math about MTS, but experimental group showed higher ALPs. Conclusion：The effect of the β-TCP/Col composite to BMSCs in bone formation activity is positive, and no negative influence was found in cell proliferation .

materials；BMSCs；bone formation

黑龙江省自然科学基金，编号：H201487。

丁义(1990～)男，河北张家口人，在读硕士研究生。

赵刚(1975～)男，黑龙江依兰人，硕士，副主任医师，副教授，硕士研究生导师。E-mail:13504545575@126.com。

R

B

1008-0104(2017)03-0012-02

2016-12-05)