PP2A抑制剂对宫颈癌细胞Ca ski辐射敏感性的影响

方银花， 李晓琴， 任 泂， 唐才智， 冉新泽， 粟永萍 ， 程红缨△

第三军医大学 1护理学院 2预防医学院全军复合伤研究所(创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室)，重庆 400038

PP2A抑制剂对宫颈癌细胞Ca ski辐射敏感性的影响

方银花1， 李晓琴1， 任 泂2， 唐才智2， 冉新泽2， 粟永萍2， 程红缨1△

第三军医大学1护理学院2预防医学院全军复合伤研究所(创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室)，重庆 400038

目的 探索蛋白磷酸酶2A(PP2A)抑制剂LB-100对宫颈癌细胞Ca ski辐射敏感性的影响。方法 Ca ski(宫颈癌细胞株)及CCD 841 CoN(正常小肠上皮细胞株)给予不同浓度梯度(0～100 μmol/L)LB-100处理24 h后，以CCK-8法检测细胞活性，筛选最佳药物作用浓度。在此药物浓度下，以对照(PBS)、单纯LB-100、单纯辐照及LB-100联合辐照等方式处理细胞(辐照剂量为0、2、4、6 Gy)，通过平板克隆实验分别观察LB-100对Ca ski和CCD 841 CoN辐射敏感性的影响；再以相同的方式处理(细胞辐照剂量为6 Gy)，通过流式细胞术检测凋亡及细胞周期，初探LB-100增强Ca ski辐射敏感性的机制。结果 LB-100对Ca ski及CCD 841 CoN的抑制作用呈药物剂量依赖性；2.5 μmol/L LB-100增强Ca ski细胞辐射敏感性，但对CCD 841 CoN的辐射敏感性无显著影响；LB-100联合辐照处理促进Ca ski细胞凋亡，LB-100联合辐照组细胞凋亡率与单纯辐照组比较差异有统计学意义[(8.76±1.02)%vs.(4.65±0.72)%，P<0.01]；LB-100可下调Ca ski细胞G0/G1期所占比例，LB-100联合辐照组与单纯辐照组比较差异有统计学意义[(19.87±2.54)%vs.(30.73±1.18)%，P<0.05]。结论 PP2A抑制剂LB-100通过促进凋亡、影响细胞周期，增强了人宫颈癌细胞株Ca ski的辐射敏感性，同时，其对正常肠上皮细胞CCD 841 CoN无辐射增敏作用，有望成为临床上增强宫颈癌放射治疗疗效的辅助药物。

蛋白磷酸酶2A(PP2A)； 宫颈癌； 辐射敏感性； 细胞周期

由于不健康的生活方式、老龄化及环境污染等影响，宫颈癌已成为威胁全球女性健康的主要恶性肿瘤之一，位居女性癌症死亡原因的第2位[1]。在发展中国家由于人类乳头瘤病毒(HPV)的感染更加广泛，宫颈癌疫苗不能广泛地推广使用，使得宫颈癌在发展中国家更为常见。在中国等亚洲国家，HPV病毒感染导致的宫颈癌患者人群更有年轻化的趋势[2]。

放疗是宫颈癌的主要治疗手段，但是由于宫颈癌位置特殊，其放疗常常导致严重的放射性肠炎，使患者预后变差，且放射性肠炎的出现及其严重程度与辐射剂量的大小具有直接的相关性[3]。因此需要一种对正常肠道组织无明显副作用的放疗增敏剂，在相对低的辐照剂量下，达到显著的抗肿瘤效果。LB-100是新研发的一种竞争性抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性的水溶性小分子化合物，在动物模型上已证实其能够有效增强多种肿瘤细胞如骨肉瘤、鼻咽癌等对放化疗的敏感性[4]，Ⅰ期临床研究也证明了其具有良好的抗肿瘤作用[5]。但目前尚未见LB-100对宫颈癌辐射敏感性的研究报道。因此，本研究旨在探讨LB-100对宫颈癌细胞株Ca ski辐射敏感性的作用，并关注其对正常肠上皮细胞CCD 841 CoN的作用，以期为宫颈癌的临床放射治疗和患者受照后的护理提供一定的指导。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

人宫颈癌细胞系Ca ski及人正常肠上皮细胞CCD 841 CoN(购自中国科学院细胞库)，DMEM高糖培养液(Hyclone公司)、RPMI 1640高糖培养液(Hyclone公司)、胎牛血清(Gibco公司)、LB-100(Selleck公司)、Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒(Dojindo公司)、结晶紫溶液(上海碧云天公司)、碘化丙啶(propidium iodide，PI，BD公司)、凋亡检测试剂盒(BD公司)，RS2000辐照仪(Rad source Technologies，美国)。

1.2 Ca ski、CCD 841 CoN细胞培养方法

细胞于含有10%胎牛血清的DMEM或RPMI 1640高糖培养液中，在37℃、5%CO2的孵育箱中培养，24～48 h进行一次细胞消化传代，传代2、3次的细胞用于实验。

1.3 细胞辐照

给予细胞X线照射，电流25 mA，电压160 kV，剂量率为1.284 Gy/min，照射时间0、93、187、280 s，对应辐照总剂量分别为0、2、4、6 Gy。

1.4 细胞增殖毒性分析

将细胞接种于96孔板，设置4个复孔，空白孔2个，适应性生长24 h，更换培养液并按浓度梯度0、1、2.5、5、10、20、50、100 μmol/L的LB-100处理24 h。加入10 μL/孔的CCK-8试剂，细胞培养箱内孵箱1～4 h，用酶标仪检测波长A450 nm下的吸光度(A)值，计算细胞相对存活率。细胞存活率=[(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)]×100%。

1.5 平板克隆形成能力评估

将单细胞悬液按照600个/孔接种到6孔板内，并分为PBS组和LB-100组，各设置3个复孔。待细胞贴壁生长24 h后，按照分组方式给予1×PBS或2.5 μmol/L LB-100，3 h后给予X射线辐照，剂量分别为0、2、4、6 Gy。随后置于细胞培养箱继续孵育，24 h后将所有分组细胞的培养液更换为新鲜培养液，之后每3天更换培养液1次，并进行观察，共培养12 d，进行结晶紫溶液染色，克隆数统计，计算克隆形成存活分数，公式为：存活分数(%)=实验组克隆形成数/正常对照组克隆形成数×100%

1.6 流式细胞术分析细胞凋亡

将处于对数生长期的Ca ski细胞消化后制成单细胞悬液，进行细胞计数，接种3.5×105个细胞于6孔板的每个孔中，分组为：对照组、单纯LB-100组、单纯辐照组、LB-100联合辐照组。待细胞贴壁生长24 h，按照分组方式给予1×PBS或LB-100(2.5 μmol/L)，3 h后进行0 Gy或6 Gy(克隆形成实验的最大辐照剂量)的X射线辐照。辐照后24 h，收集细胞，2 000 r/min 4℃离心5 min，1×PBS洗涤细胞2次。再次离心细胞，弃掉PBS，按照BD公司AnnexinⅤ-APC/PI细胞凋亡双染试剂盒说明书进行细胞双染料染色。轻轻混匀细胞，过滤后用流式细胞仪进行检测。凋亡率为Annexin Ⅴ阳性细胞所占比例。

1.7 流式细胞术细胞周期检测

细胞分组和处理方法同1.6，收集的细胞经预冷的75%乙醇4℃固定过夜。弃掉乙醇溶液，1×PBS重悬细胞，3 000 r/min离心5 min，此步骤重复一次。每样本加入50 mg/mL RNA酶80 μL，37℃孵育30 min。之后每样本加入50 μg/mL PI染液100 μL，混匀后，室温避光孵育10 min。轻轻混匀细胞，过滤后经流式细胞仪检测。

1.8 统计学处理

图像用GraphPad prism 6.01进行绘制，使用SPSS 13.0统计软件处理数据，组间比较比较采用完全随机设计单因素方差分析。以P=0.05为检验标准。

2 结果

2.1 LB-100对Ca ski和CCD 841 CoN细胞存活率的抑制作用呈剂量依赖性

如图1所示，LB-100浓度≥2.5 μmol/L时，对Ca ski存活有抑制作用，且该抑制作用呈浓度依赖性。而当LB-100浓度>5 μmol/L时，才对CCD 841 CoN细胞存活有抑制作用，且该抑制作用呈浓度依赖性。当LB-100浓度>5 μmol/L时，在同一浓度下，LB-100对这两种细胞的抑制作用差异无统计学意义。

图1 不同浓度LB-100处理24 h后Ca ski、CCD 841 CoN的相对存活率Fig.1 The relative survival of Ca ski and CCD 841 CoN after LB-100 treatment for 24 h with different concertrations

2.2 LB-100对Ca ski及CCD 841 CoN细胞辐射敏感性的影响

结果如图2，辐照剂量为2 Gy和4 Gy时，Ca ski细胞的存活分数PBS组与LB-100组比较分别为(74.56±2.40)%vs.(23.42±2.70)%，P<0.01及(30.73±7.60)%vs.(6.55±1.20)%，P<0.01，LB-100联合辐照的克隆形成能力显著低于单纯辐照(图2A)；但相同辐照剂量下，CCD 841 CoN的存活分数PBS组与LB-100组比较，差异无统计学意义(图2B)。未辐照(0 Gy)或给予大剂量辐照(6 Gy)

时，Ca ski的存活分数PBS组与LB-100组比较差异无统计学意义(P>0.05)。未辐照(0 Gy)时，CCD 841 CoN的存活分数PBS组与LB-100组比较差异有统计学意义[(100.00±0.77)%vs.(89.23±2.3)%，P<0.05]；大剂量辐照(6 Gy)时，CCD 841 CoN的存活分数PBS组与LB-100组比较差异无统计学意义。

2.3 LB-100诱导Ca ski细胞凋亡

如图3，对照组、单纯LB-100组、单纯辐照组、LB-100联合辐照组的细胞凋亡率分别为(0.15±0.16)%、(7.19±0.22)%、(4.65±0.72)%和(8.76±1.02)%，与对照组比较，单纯LB-100组、单纯辐照组、LB-100联合辐照组的凋亡率均增加(均P<0.01)。LB-100联合辐照组的凋亡率高于单纯辐照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。单纯LB-100组与LB-100联合辐照组比较差异无统计学意义。

2.4 LB-100促使Ca ski细胞G0/G1期比例减少

图4结果显示，与对照组比较，单纯LB-100组、单纯辐照组、LB-100联合辐照组处于G0/G1期的Ca ski细胞比例均减少，差异均具有统计学意义(均P<0.05)，呈逐渐递减趋势。单纯辐照组与单纯LB-100组处于G0/G1期的细胞比例比较差异无统计学意义；单纯辐照组与LB-100联合辐照组比较，后者处于G0/G1期细胞比例较低(P<0.01)。

A：Ca ski细胞；B：CCD 841 CoN细胞；*P<0.05，**P<0.01图2 LB-100(2.5 μmol/L)对不同辐照剂量下Ca ski及CCD 841 CoN细胞存活分数的影响Fig.2 Effect of LB-100(2.5 μmol/L)on survival fraction of Ca ski and CCD 841 CoN under different radiation doses

A：细胞凋亡检测流式细胞图；B：各组凋亡率比较。a：对照组；b：单纯LB-100组；c：单纯辐照组；d：LB-100联合辐照组。**P<0.01图3 LB-100和(或)辐照处理后24 h Ca ski细胞凋亡检测结果Fig.3 Apoptosis of Ca ski 24 h after treatment by LB-100 and(or) radiation

A：细胞周期检测流式细胞图；B：细胞周期分布图；C：G0/G1期所占比例比较图。a：对照组；b：单纯LB-100组；c：单纯辐照组；d：LB-100联合辐照组。*P<0.05，**P<0.01图4 LB-100和(或)辐照处理后24 h Ca ski细胞周期检测结果Fig.4 Cell cycle distribution of Ca ski 24 h after treatment by LB-100 and (or) radiation

3 讨论

蛋白磷酸酶2A(PP2A)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，通过调控去磷酸化在细胞凋亡、细胞周期、有丝分裂、DNA损伤应答等细胞生命过程中发挥重要的作用[6]。有研究发现抑制PP2A活性，联合使用放、化疗，会使静止的肿瘤干细胞进入有丝分裂，负性调节放化疗引起的DNA损伤防御机制，导致肿瘤细胞发生凋亡和有丝分裂灾难，从而增强肿瘤对放化疗的敏感性[4]。LB-100是新合成的一种选择性抑制PP2A的水溶性小分子化合物，在动物肿瘤模型及体外细胞培养实验中，LB-100能够增强恶性胶质瘤、鼻咽癌、肝癌、胰腺癌等多种肿瘤对辐射或者化疗药物的敏感性[7]。同时，其对肝、肾等脏器无明显的毒性作用，目前处于Ⅰ期临床研究阶段[8]。

本研究以宫颈癌细胞Ca ski和正常肠上皮细胞CCD 841 CoN作为研究对象，首次探索PP2A抑制剂LB-100对宫颈癌细胞Ca ski辐射敏感性的影响，同时关注其对正常肠上皮细胞CCD 841 CoN的作用。首先以CCK-8法检测LB-100对Ca ski及CCD 841 CoN细胞活性的影响，筛选出LB-100使用的安全浓度(即对正常肠上皮细胞无明显抑制作用的浓度)，结果显示，浓度<5 μmol/L时，LB-100对Ca ski及CCD 841 CoN均无明显抑制作用，因此选用较低浓度(2.5 μmol/L)作为后续实验的给药方案。

克隆形成实验是细胞增殖能力的最可靠的检测手段，被广泛运用于评估药物疗效的实验研究当中[9]。本研究Ca ski的克隆形成实验结果表明，除大剂量6 Gy辐照时(辐射本身导致Ca ski形成克隆的能力低下)，LB-100组与PBS组克隆形成分数比较无差异外，在2 Gy和4 Gy辐照剂量下，LB-100均显著增强了Ca ski的辐射敏感性。但对CCD 841 CoN的辐射敏感性无明显影响。

凋亡是射线导致肿瘤细胞死亡的主要路径之一[10]，本研究凋亡检测结果显示，LB-100可诱导Ca ski细胞发生辐照后的凋亡，提示LB-100对Ca ski细胞的辐射增敏作用可能与促进凋亡有关，但具体的分子机制还有待进一步的研究。放射线及化疗药物抗肿瘤的主要作用靶细胞是一群快速增殖的细胞，而对于处于休眠不增殖的肿瘤细胞则无效，导致肿瘤对放化疗产生抵抗[11]。因此促使休眠的肿瘤细胞进入细胞周期循环中，有利于放射线及化疗药物更好地发挥抗肿瘤作用[12]。有丝分裂灾难是近来提出的一种有别于凋亡和坏死的细胞死亡方式，指在应激状态下，一系列信号通路被激活，有丝分裂进程受阻，大量多倍体形成，有丝分裂发生异常，从而导致细胞在分裂期发生死亡的现象[13]。有研究证明抑制PP2A的活性，可促使恶性胶质瘤细胞G0/G1期比例减少，S期和G2/M期明显增多，导致有丝分裂灾难的发生，增强了化疗药物替莫唑胺的抗肿瘤作用[14]。在本研究中对细胞周期的检测发现有类似结果，LB-100联合辐照促使Ca ski细胞G0/G1期比例相对于其它组明显减少，继而S期和G2/M期比例增多，以此推测LB-100增强Ca ski辐射敏感性的可能原因是，促使损伤肿瘤细胞过早地进入细胞周期并进行有丝分裂，导致Ca ski细胞更容易发生凋亡和有丝分裂灾难性死亡[7]，但还需要更进一步的分子机制加以证明。

对于本研究结果中，为何LB-100的辐射增敏作用单纯针对宫颈癌细胞株Ca ski，而对正常肠上皮细胞株CCD 841 CoN的辐射敏感性无影响，可能的解释是，在磷酸化水平发生变化时，拥有较多基因突变的肿瘤细胞对辐射更加敏感[7]，但具体的机制还有待进一步研究。

综上所述，本研究证明了安全剂量LB-100能增强人宫颈癌细胞Ca ski的辐射敏感性，对正常小肠上皮细胞CCD 841 CoN的辐射敏感性无影响。结果提示，LB-100增强Ca ski辐射敏感性的机制可能是促进细胞凋亡和影响细胞周期进程，为优化临床宫颈癌治疗方案提供了新的线索。但本研究只用了一种宫颈癌细胞株，如果要证明LB-100对宫颈癌的辐射敏感性的普遍适用性，还需要在多种宫颈癌细胞株中进行实验，并利用荷瘤动物实验来证明。

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(2017-03-01 收稿)

Effect of Protein Phosphatase 2A Inhibitor on Radiosensitivity of Cervical Carcinoma Cell Line Ca ski

Fang Yinhua1，Li Xiaoqin1，Ren Jiong2etal

1DepartmentofFundamentalNursing，CollegeofNursing，2InstituteofCombinedInjury，StateKeyLaboratoryofTrauma，BurnsandCombinedInjury，CollegeofPreventiveMedicine，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038，China

Objective To investigate the effect of LB-100，an inhibitor of protein phosphatase 2A(PP2A)，on the radiosensitivity of cervical cancer cell line Ca ski.Methods The cell lines Ca ski(cervical carcinoma cell line)and CCD 841 CoN(human normal intestinal epithelial cell line)were exposed to LB-100(0 to 100 μmol/L)for 24 h.CCK-8 assay was used to analyze the cell viability and then the best drug concentration screened out.At this drug concentration，we treated Ca ski and CCD 841 CoN with PBS，LB-100 only，radiation only and LB-100 plus radiation (radiation dose：0，2，4，6 Gy)，to observe the radiosensitivity of LB-100 on Ca ski and CCD 841 CoN respectively through clonogenic assay.Then we investigated the mechanism by which LB-100 enhanced the radiosensitivity of Ca ski through detection of cell apoptosis and cell cycle via flow cytometry.Results LB100 showed modest dose-dependent inhibition of Ca ski and CCD 841 CoN cells；LB-100(2.5 μmol/L)enhanced the radiosensitivity of Ca ski，while there was no radiosensitization on CCD 841 CoN cells；LB100 plus radiation enhanced the apoptosis of Ca ski，and there was a statistically significant difference in apoptosis rate between LB-100 plus radiation group and radiation only group[(8.76±1.02)%vs.(4.65±0.72)%，P<0.01]；LB-100 reduced the proportion of Ca ski in G0/G1phase，there was a statistically significant difference between LB-100 plus radiation group and radiation only group [(19.87±2.54)%vs.(30.73±1.18)%，P<0.05].Conclusion PP2A inhibitor，LB-100 enhances the radiosensitivity of the cervical cancer cell Ca ski，by inducing apoptosis and influencing the cell cycle distribution.And at the same time，it has no effect on radiosensitivity of the normal intestinal epithelial cell line CCD 841 CoN，indicating that LB-100 would be a kind of adjuvant drug to enhance clinical radiotherapy effect of cervical cancer.

protein phosphatase 2A(PP2A)； cervical cancer； radiosensitivity； cell cycle

R737.33

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.013

方银花，女，1990年生，硕士研究生，E-mail：434681628@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：wenyi93@hotmail.com