长链非编码RNA-HOTAIR对乳腺癌细胞MCF-7侵袭转移能力的影响*

吕 峰， 孔舒欣， 于 洋， 梁 栋， 张 斌

河南省人民医院乳腺外科，郑州 450003

长链非编码RNA-HOTAIR对乳腺癌细胞MCF-7侵袭转移能力的影响*

吕 峰， 孔舒欣， 于 洋， 梁 栋， 张 斌△

河南省人民医院乳腺外科，郑州 450003

目的 检测乳腺癌肿瘤组织中HOX转录反义RNA(HOTAIR)的表达，并观察HOTAIR对乳腺癌细胞系MCF-7侵袭转移能力的影响。方法 应用荧光定量PCR检测32对乳腺癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织中HOTAIR的表达差异；通过慢病毒转染构建稳定高表达HOTAIR的MCF-7细胞株，Transwell检测高表达HOTAIR对细胞侵袭能力的影响，光学显微镜下观察细胞的形态学变化， Western blot法检测上皮-间质转化(EMT)相关蛋白的变化。裸鼠尾静脉注射HOTAIR高表达的MCF-7细胞，观察肝脏转移瘤的形成。结果 在32对乳腺癌临床标本中，有24例肿瘤组织中HOTAIR的表达高于癌旁正常组织；MCF-7高表达HOTAIR后，细胞的侵袭能力增强，细胞发生EMT为特征的形态学变化，EMT相关的E-cadherin表达降低，而Vimentin及Slug的表达升高。高表达HOTAIR的MCF-7细胞肝脏转移瘤成瘤能力更强。结论 乳腺癌临床标本中HOTAIR的表达增高，乳腺癌细胞系MCF-7中高表达HOTAIR可诱使其发生EMT，并促进其侵袭转移。

长链非编码RNA； HOX转录反义RNA； 乳腺癌； 侵袭转移； 上皮-间质转化

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt的RNA，其本身虽然不编码蛋白，但能以转录调控、表观遗传学修饰、蛋白降解等多种形式调控基因的表达[1]。HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)存在于HOX基因中，是第1个被发现具有反式转录调节作用的lncRNA。既往研究证实HOTAIR在鼻咽癌、恶性淋巴瘤、肝细胞癌等多种肿瘤中表达异常，并参与肿瘤的增殖及侵袭转移等[2-4]。但HOTAIR在乳腺癌中的表达及功能尚不完全清楚，本文旨在研究HOTAIR对乳腺癌细胞系MCF-7上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及侵袭转移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 临床标本

32对乳腺癌临床标本由河南省人民医院乳腺外科于手术中取得，每对标本中包括乳腺癌肿瘤组织及肿瘤旁正常组织，标本取得前获患者及家属同意，并签署知情同意书。

1.2 主要实验材料

人乳腺癌细胞系MCF-7购于美国ATCC细胞库公司，培养于含有10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养液中，置于37℃、5%二氧化碳温箱内。抗E-cadherin抗体(CST，No.3195)、抗Vimentin抗体(CST，No.5741)、抗Snail抗体(CST，No.3879)、抗Slug抗体(CST，No.9585)、抗Zeb1抗体(CST，No.3396)及抗内参GAPDH抗体(CST，No.5174)、预铺好Matrigel的Transwell(8 μm孔径)等均购自武汉启动子生物有限公司。PCR引物(由广州锐博生物有限公司设计并合成)：HOTAIR上游引物 5′-GGAGTGAGTCCCATCCATCT-3′，下游引物5′-TGCCCAATGGTACTACAGAAG-AT-3′；U6上游引物5′-GACAAGCCCTACCTACAG-3′，下游引物5′-GATGATACAGTACAA-GTCGC-3′。

1.3 实验分组

共分为3组，分别为稳定高表达HOTAIR的MCF-7细胞株(HOTAIR)、感染对照空病毒的MCF-7细胞株(Vector)及未处理原始MCF-7细胞株(Blank)。稳定细胞系均由本实验室前期构建，病毒感染MCF-7细胞株24 h后换液，并加入浓度为1 μg/mL的嘌呤霉素筛选稳定株，2周后进行冻存保种。

1.4 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) 检测

剪碎肿瘤组织及肿瘤旁正常组织或收集各组MCF-7细胞，利用Trizol法提取组织或细胞的总RNA，利用逆转录试剂盒(Fermentas，No.K1633)将RNA逆转录形成cDNA文库，之后利用实时荧光定量PCR试剂盒(Fermentas，No.K2190)行PCR扩增，扩增条件：95℃预扩增3 min； 95℃ 1 min，57℃ 30 s，72℃ 1 min，40个循环；72℃延伸10 min，机型为ABI7300荧光定量PCR仪。采用2-ΔΔCt方法计算细胞中HOTAIR的相对表达量。

1.5 侵袭能力实验

收集各组MCF-7细胞，重悬于无血清RPMI-1640培养液，细胞计数法计数细胞并将各组细胞稀释为相同密度；Transwell小室下室内每孔加入约500 μL含10%胎牛血清的完全培养液，上室内先每孔加入10 μL的Matrigel，并置于37℃温箱孵育30 min，待Matrigel完全凝固后，再每孔加入5×105细胞混悬液，置于37℃培养箱中继续培养24 h后，弃掉培养液上清，加入足量多聚甲醛固定细胞，以0.01%结晶紫行细胞染色，最终在光学显微镜(20×10倍)下计数穿膜细胞数，随机选取5个视野，计算细胞数平均值，每组样本设3个复孔，相同独立实验重复3次。

1.6 细胞形态学观察

将各组处理后的MCF-7细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，将6孔板置于倒置光学显微镜下，观察MCF-7细胞在高表达HOTAIR后的形态学变化并拍照。

1.7 免疫印迹(Western blot)法检测

收集各组处理后的MCF-7细胞，加入适量NP-40全细胞蛋白裂解液，获取细胞总蛋白样品，BCA法测定各裂解液的蛋白浓度，加入适量SDS-loading buffer在100℃水浴锅中孵育10 min，后行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，PVDF膜湿转法转膜，并用5%BSA溶液封闭30 min后，分别孵育E-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、Zeb1及GAPDH一抗及二抗，最后用ECL显色液化学法显影。

1.8 动物实验

以稳定高表达HOTAIR的MCF-7细胞株(HOTAIR)和感染对照空病毒的细胞株(Vector)为工具，以裸鼠为动物对象，通过尾静脉注射细胞103个/只，8周后脱颈法处死小鼠，解剖分离肝脏，通过肉眼计数肝脏转移灶(metastasis clone formation)及肝脏组织切片苏木精-伊红染色计数微小转移灶(micrometastasis formation)，比较HOTAIR对MCF-7肿瘤细胞肝脏转移能力的影响。

1.9 统计学方法

用SPSS 13.0统计学软件进行统计分析。实验数据以均数±标准差表示，组间均数比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HOTAIR在乳腺癌临床标本中表达增加

通过Real-time PCR检测32对乳腺癌肿瘤组织及对应相邻正常组织中HOTAIR的表达，利用U6作为内参，结果提示在其中24例标本中，肿瘤组织中的HOTAIR的表达高于相邻正常组织(图1)。

2.2 HOTAIR稳定高表达细胞株构建成功

在乳腺癌细胞系MCF-7中通过慢病毒感染获得稳定高表达HOTAIR的细胞株，该细胞株由本实验室既往构建。通过Real-time PCR检测MCF-7中HOTAIR的表达，结果提示稳定细胞中HOTAIR的表达较对照组升高17倍(t=10.735，P<0.05)，证明HOTAIR稳定高表达细胞株构建成功(图2)。

图1 HOTAIR在乳腺癌临床标本中高表达Fig.1 Up-regulated expression of HOTAIR in breast cancer tissues

2.3 高表达HOTAIR可促进乳腺癌细胞系MCF-7的侵袭

Transwell法检测细胞侵袭能力结果提示：Vector对照组穿膜细胞数为(32±8)个/视野，高表达HOTAIR组为 (122±7)个/视野，穿膜细胞数显著增加，差异有统计学意义(t=16.359，P<0.05)，见图3。

图2 构建稳定高表达HOTAIR的MCF-7细胞株Fig.2 Construction of high HOTAIR expression MCF-7 cell line

2.4 高表达HOTAIR可使MCF-7细胞发生形态学变化

将各组MCF-7细胞接种于6孔板中48 h后，用普通光学显微镜观察。结果提示：MCF-7细胞高表达HOTAIR后，与对照组相比，发生明显的EMT变化，如细胞变长呈梭形，伪足变长且数目增多，细胞间有较大的间隙等，而感染对照空病毒及未感染的细胞形态学没有明显变化(图4)。

图3 高表达HOTAIR促进MCF-7的侵袭能力(×200)Fig.3 High expression of HOTAIR promotes MCF-7 cell invasion(×200)

图4 高表达HOTAIR促进MCF-7发生细胞形态学改变(×200)Fig.4 High expression of HOTAIR promotes the morphological changes of MCF-7 cells(×200)

2.5 高表达HOTAIR可促进MCF-7细胞发生EMT

Western blot检测结果发现：高表达HOTAIR细胞中E-cadherin的蛋白表达明显下降，Vimentin的表达明显上升，前者是上皮细胞的标志性蛋白，而后者是间质来源细胞的标志性蛋白；Snail、Slug及Zeb1均为细胞发生EMT时重要的转录因子，检测结果显示，高表达HOTAIR细胞中Slug的表达水平明显上升，而Snail及Zeb1的表达水平无变化(图5)。

图5 高表达HOTAIR诱导EMT相关蛋白表达改变Fig.5 High expression of HOTAIR induces changes of EMT-related protein expression

2.6 高表达HOTAIR可促进MCF-7细胞肝脏转移瘤的形成

将高表达HOTAIR的细胞株及感染对照空病毒的细胞株分别注射于裸鼠尾静脉中，8周后观察肝脏形成的转移灶(图6)。结果提示：高表达HOTAIR细胞株形成肉眼可见转移灶的比例(5/10)高于对照组(1/10)；形成微小转移灶的比例(10/10)也高于对照组(4/10)。

A：肝脏转移灶大体观；B：显微镜下观察正常肝组织(左)及转移灶(右)(苏木精-伊红染色，×200)图6 高表达HOTAIR促进肝脏转移瘤形成Fig.6 High expression of HOTAIR promotes liver metastasis

3 讨论

随着人类基因组计划的完成和近年来高通量新一代测序技术的普及，人们发现基因组中包含大约20 000个蛋白编码基因，约占基因组的5%左右，另外95%的序列均为非编码RNAs(non-coding RNAs，ncRNAs)[5]。ncRNAs根据其核苷酸片段的长度，大致分为lncRNA(长链非编码RNA)及microRNA(微小RNA)，近年来对microRNA的研究表明，其可以通过一系列的转录后调控参与蛋白质的翻译[6-7]，而针对lncRNA的研究较少。lncRNA不同于microRNA，其可以通过多种方式参与细胞的生物学功能调控，如表观遗传学、转录前调控、转录调控及转录后调控等等[5]。

HOTAIR作为第1个被发现具有反式转录调控功能的lncRNA，针对其功能的研究较多，且多半集中于其在各种肿瘤发生发展中的作用。近年来研究发现HOTAIR不仅在鼻咽癌、肝细胞癌及前列腺癌等多种上皮来源实体肿瘤中表达升高，在恶性淋巴瘤、白血病等间叶组织来源肿瘤中也具有一定的作用。一般来说，高表达HOTAIR能够促进肿瘤细胞的细胞周期进程及细胞增殖，增强肿瘤细胞的局部浸润及远处转移的能力，并且能够减低肿瘤细胞对各种细胞周期毒性化疗药物的敏感性，这些提示HOTAIR在肿瘤的发生发展中扮演了重要的角色[2-4]。在乳腺癌的研究中亦有报道HOTAIR可以增强MDA-MB-231乳腺癌细胞放疗抵抗，同时研究发现在体外高表达HOTAIR能够促进乳腺癌细胞的增殖[8-9]。本文针对HOTAIR在乳腺癌中的表达及功能做了进一步的体外和体内研究。

我们首先在乳腺癌临床标本中检测HOTAIR的表达差异，结果表明，相对于肿瘤旁的正常组织，肿瘤内HOTAIR的表达更高，这提示HOTAIR有可能参与乳腺癌的发生发展。进一步，我们在体外传代培养的乳腺癌细胞系MCF-7中，通过慢病毒感染构建稳定高表达HOTAIR的细胞株，观察并验证HOTAIR的功能。Transwell是检测细胞侵袭能力的常用实验方法，Matrigel形成的膜性结构与体内肿瘤细胞发生远处转移时需要通过的组织、血管基底细胞膜相类似，我们发现，MCF-7细胞高表达HOTAIR后，MCF-7细胞的穿膜个数增加，该体外实验表明，高表达HOTAIR能够促进细胞的侵袭能力。

为了探索HOTAIR促进肿瘤细胞侵袭能力的具体机制，我们在显微镜下观察高表达HOTAIR后MCF-7的细胞形态。结果提示MCF-7细胞高表达HOTAIR后，与对照组相比，发生明显的EMT变化，如细胞变长呈梭形，伪足变长且数目增多，细胞间有较大的间隙等，而感染对照空病毒及未感染的细胞形态学没有明显变化。EMT是一种重要的生物学效应，一般认为在胚胎发育及器官形成中发挥着重要的功能。近年来研究表明，EMT是上皮来源肿瘤发生远处转移的一种细胞学机制[10]。肿瘤细胞发生EMT后，细胞间的黏连性降低，细胞间的接触抑制减弱，细胞运动及受募集因子影响的能力增加，从而为肿瘤细胞的转移创造了条件。我们通过免疫印迹法检测高表达HOTAIR后对MCF-7细胞中E-cadherin、Vimentin、Snail、Slug及Zeb1等EMT相关的主要蛋白水平的影响，结果提示，上皮标志E-cadherin表达降低，间质标志Vimentin表达增高；在Snail及Zeb1没有明显变化的同时，Slug的表达明显增加，而后者是细胞发生EMT时表达变化的重要转录因子之一，提示HOTAIR可能通过调控Slug进而促进乳腺癌EMT及侵袭转移。最后我们在裸鼠的转移瘤模型中验证了上述结果，证实高表达HOTAIR可以促进肝脏转移瘤形成。

综上所述，我们的研究发现，在乳腺癌临床标本中HOTAIR的表达增高，在乳腺癌细胞系MCF-7中高表达HOTAIR，细胞侵袭能力增强，并发生类似EMT的形态学变化及蛋白表达改变。在高表达HOTAIR后Slug的表达明显上升，提示Slug可能作为主要调控因子参与HOTAIR介导的EMT改变。但HOTAIR如何调控Slug的蛋白表达，通过何种具体的分子生物学机制尚待阐明，也是我们进一步的研究内容。本文提示HOTAIR可能参与乳腺癌的发生发展，为乳腺癌的临床治疗提供了新的药物靶点及监测指标。

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(2017-03-06 收稿)

Effect of HOTAIR on Invasion and Metastasis of Breast Cancer MCF-7 Cells

Lv Feng，Kong Shuxin，Yu Yangetal

DepartmentofBreastSurgery，HenanProvincialPeople’sHospital，Zhengzhou450003，China

Objective To test the expression of HOTAIR in the human breast cancer tissues，and to observe the effect of HOTAIR on the invasion and metastasis of breast cancer cell line MCF-7.Methods Total RNA from the breast cancer tissues and paracancerous normal tissues of 32 patients with breast cancer was prepared respectively，and the expression of HOTAIR was tested by real time PCR.MCF-7 cells were transfected with lentivirus，and then HOTAIR was stably and highly expressed.Effect of high HOTAIR expression on invasion of MCF-7 cells was detected by Transwell assay.The change of cell morphology was observed by optical microscope.The expression of epithelial-mesenchymal transition(EMT)related protein was detected by Western blotting.The cells highly expressing HOTAIR were injected into the tail vein of nude mice to observe formation of liver metastasis tumor. Results In all 32 pairs of breast cancer samples，the expression of HOTAIR was higher in tumor tissues than in the paracancerous normal tissues of 24 patients.The invasion of MCF-7 cells was enhanced after HOTAIR overexpression，with cell morphology changes，and the expression of E-cadherin was depressed，with elevation of Vimentin and Slug，which are related to the progress of EMT.The cells highly expressing HOTAIR had a better ability of formation of liver metastasis tumor.Conclusion The expression of HOTAIR is elevated in breast cancer，and the high expression of HOTAIR can induce EMT，and enhance the invasion and metastasis of MCF-7 cells.

long non-coding RNA； HOTAIR； breast cancer； invasion and metastasis； epithelial-mesenchymal transition

*河南省科技厅基金资助项目(No.152300410153)

R737.9

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.006

吕 峰，男，1978年生，主任医师，E-mail：fenglv1978@gmail.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：9362159@qq.com