无创性胎儿常见染色体非整倍体筛查与结果分析

张媛媛，刘晓亮，初国铭，崔婉婷，何蓉，赵彦艳

(中国医科大学附属盛京医院，沈阳 110004)

·论著·

无创性胎儿常见染色体非整倍体筛查与结果分析

张媛媛，刘晓亮，初国铭，崔婉婷，何蓉，赵彦艳

(中国医科大学附属盛京医院，沈阳 110004)

目的 探讨无创性胎儿常见染色体非整倍体筛查的应用价值。方法 收集5 469例孕妇外周血标本，提取血浆游离DNA进行高通量测序筛查胎儿染色体非整倍体，对21、18、13和性染色体三体高风险者行羊水或脐血穿刺，进行多重定量荧光PCR(QF-PCR)检测和染色体核型分析验证。结果 无创筛查出染色体非整倍体高风险样本71例(1.3%)，其中21-三体30例(1例为嵌合型)、18-三体7例、13-三体6例、X染色体数量增多11例、X染色体数量减少17例。21、18、13-三体除有5例未做介入性产前诊断，3例为假阳性外，其余均与QF-PCR和核型分析验证结果一致。性染色体阳性结果者经核型分析验证有13例为异常，准确率为46.4%。其余5 398例无创筛查阴性结果者后期经B超监测和电话随访，未发现21、18、13以及性染色体非整倍体患儿。结论 无创性胎儿染色体非整倍体筛查技术对21、18、13-三体的检测准确性较高，可以作为传统产前筛查诊断策略的有益补充，但对性染色体非整倍体检测的准确性较低，尚需进一步优化检测和分析方法。

染色体非整倍体；产前筛查；DNA高通量测序技术；血浆游离DNA

染色体非整倍体是出生缺陷最常见的遗传性病因，常见类型有21-三体、18-三体、13-三体、X-三体、Klinefelter综合征、Turner综合征等[1]。患儿常表现为先天性非进行性智力障碍，生长发育迟缓和(或)合并畸形，目前尚无有效的治疗方法。传统的产前筛查和诊断方法(孕早期超声检查、孕中期血清学筛查、羊水细胞染色体核型分析)均有一定的局限性。随着新一代测序技术研究的深入，无创性胎儿基因检测得到了快速发展，其通过对孕妇外周血血浆游离DNA检测，经生物信息学分析，可无创筛查胎儿常见染色体非整倍体，已成为国内外产前筛查的热点项目。本研究采用多重定量荧光(QF)-PCR检测和核型分析验证，评估无创性胎儿常见染色体非整倍体筛查在产前筛查诊断中的价值，为该技术在临床合理应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1～12月于中国医科大学附属盛京医院产科和遗传科就诊，并自愿接受无创性胎儿常见染色体非整倍体筛查的孕妇5 469例。孕妇均为单胎妊娠，孕周为12～34+6周。采用Cell-Free DNA BCT管(Streck，美国)采集静脉血8～10 mL用于检测。

1.2 无创性胎儿常见染色体非整倍体筛查方法 将采血管于4 ℃下1 600 g离心10 min，吸取上清分装到1.5 mL离心管中。离心管室温16 000 g离心10 min，吸取中间层血浆约4 mL，转入3支1.5 mL血浆收集管中，取一支血浆进行检测，其余置于-80 ℃超低温冰箱保存。利用血浆游离DNA提取试剂盒(磁珠法，贝瑞和康)提取血浆游离DNA，Qubit Fluorometer核酸定量计检测DNA浓度。合格的DNA样本经文库制备、文库混合后，通过Illumina NextSeq CN500基因测序仪完成高通量测序。进入贝比安数据分析系统3.0(贝瑞和康)录入样本信息和芯片，查看质控，分析数据，判断胎儿是否为染色体非整倍体患儿。对于筛查结果为高风险孕妇，签署知情同意书后，采集羊水或脐血，进行QF-PCR检测和细胞的染色体核型分析。

1.3 羊水和脐血采集 在超声指导下行羊膜腔穿刺术采集羊水25 mL或脐静脉穿刺术采集脐血2 mL。

1.4 QF-PCR检测 按照文献[2]的方法，采用Chelex-100法提取基因组DNA。取羊水1.5 mL，12 000 r/min离心2 min，吸弃上清；取脐血20 μL，加1 mL纯水，剧烈涡旋10 s，12 000 r/min离心2 min，吸弃上清；在收集的羊水和脐血细胞中加5%Chelex-100溶液100 μL，剧烈涡旋10 s，56 ℃水浴30 min；剧烈涡旋10 s，100 ℃煮沸8 min，再剧烈涡旋10 s，12 000 r/min离心4 min，取上清用于PCR。针对21、18、13、X和Y染色体上的22个多态性短串联重复(STR)序列进行多重QF-PCR扩增，产物经PCR纯化试剂盒(AxyGene，美国)纯化、95 ℃变性、迅速冷却，于基因分析仪(ABI genetic analyzer 3730，美国)进行毛细管电泳，利用GeneMapper v4.1软件(Applied Biosystem，美国)读取片段分析数据，结合英国临床分子遗传协会(CMGS)颁布的指南“QF-PCR for the diagnosis of aneuploidy best practice guidelines(2012)v3.01”分析结果。

1.5 染色体核型分析 取羊水20 mL或脐血0.6 mL，按照常规方法进行细胞接种、培养、收获、制片和G显带，利用Leica全自动染色体分析系统进行中期细胞的扫描和图像采集，分析5个核型，计数15个中期分裂相，遇到嵌合型时增加计数至30个或以上，参照人类细胞遗传学国际命名体制ISCN(2009)进行核型分析诊断。

2 结果

5 469例孕妇无创性胎儿常见染色体非整倍体筛查结果提示高风险者71例，占样本总数的1.3%，包括21-三体30例(1例为嵌合型)、18-三体7例、13-三体6例、X染色体数量增多11例和X染色体数量减少17例。其中66例接受了羊水或脐血的多重QF-PCR检测和核型分析，其余5例高风险者(包括3例21-三体和2例18-三体)由于B超提示多发畸形，未进一步行介入性产前诊断而选择直接引产。多重QF-PCR结果和核型分析结果均显示48例与无创筛查结果一致，包括25例21-三体、5例18-三体、5例13-三体、6例47,XXN和7例(2例嵌合型)45,X，除有1例怀疑47,XXX胎儿孕妇由于本人也是47,XXX而选择继续妊娠，其余孕妇均选择终止妊娠；另2例21-三体、1例13-三体和15例性染色体数量异常高风险者QF-PCR和核型结果正常，孕妇继续妊娠，出生后经外周血染色体核型分析验证，结果均正常。见表1。5 398例无创筛查阴性结果孕妇后期经B超监测和电话随访，目前尚未发现21、18、13以及性染色体非整倍体患儿。

3 讨论

1997年Lo等[3]采用PCR法在孕妇外周血中检测到Y染色体特异性片段，证实母体外周血血浆、血清中存在胎儿游离DNA。自此，科研人员开始研究利用胎儿游离DNA进行产前胎儿基因检测。2008年，Chiu等[4]和Fan等[5]两个研究组分别对孕妇外周血中游离DNA进行高通量测序，通过计算21号染色体片段与其他所有染色体片段的比例，准确筛查出21-三体胎儿。随着新一代测序技术的快速发展，无创性胎儿常见染色体非整倍体筛查以其灵敏、准确、快速、无流产风险的优势得到了医生和孕妇的青睐，已在美国、澳大利亚等发达国家推广应用[6、7]，国内多个产前诊断中心也已广泛开展。

表1 71例无创性胎儿常见染色体非整倍体筛查高风险者多重QF-PCR检测和核型分析结果

本研究中我们成功提取5 469例孕妇的外周血血浆游离DNA并进行胎儿常见染色体非整倍体筛查，检出21、18、13-三体高风险者43例，除去5例未行介入性产前诊断，其余38例高风险者有3例是假阳性，包括2例21-三体和1例13-三体，无创筛查21、18、13-三体的总体符合率达到99.9%，敏感性为100%，特异性为99.9%。回顾国内其他研究组报道的结果，Zhou等[8]检测了7 705例份样本，发现无创DNA检测对21、18、13-三体检测的灵敏度和特异度分别为100%和99%；林颖等[9]检测了7 050例份样本，报道的敏感性和特异性分别为100%和99.96%；刘静等[10]检测了4 003例份样本，证实无创DNA检测对18、21-三体检测的符合率达100%。以上研究表明，基于新一代测序技术的无创胎儿染色体非整倍体筛查对21、18、13-三体检测具有较高的准确性。不容忽视的是本研究以及上述研究组在检测中均发现了假阳性样本，由于母体血浆中的游离DNA来源于母体和胎盘组织，因此母体嵌合、胎盘嵌合、胎儿游离DNA比例低/高等因素都可能影响筛查结果的准确性[11]。金玉霞等[12]分析了1例18-三体假阳性胎儿分娩后的胎盘组织，证实为胎盘18-三体嵌和，说明无创筛查出的高风险者尚需进一步行介入性产前诊断确诊。另外，无创筛查也能准确提示嵌合型的样本，本研究中有1例嵌合型21-三体，核型分析结果为47,XN,+21[34]/46,XN[16]，而QF-PCR对嵌合体的诊断有一定局限性，只检测出嵌合比例高的核型，提示为21-三体。

本研究中我们除筛查到21、18、13-三体外，还有28例样本为性染色体非整倍体高风险，经核型分析验证有13例为异常，准确率为46.4%，说明无创筛查胎儿性染色体非整倍体具有一定价值，但由于母体性染色体异常、胎盘嵌合等原因使无创筛查对于胎儿性染色体异常检测的准确率较低，假阳性率较高[13、14]。

产前筛查的主要目的之一是减少不必要的介入性产前诊断，无创胎儿常见染色体非整倍筛查与传统的血清学筛查相比，有较高的敏感性和特异性，对21、18、13-三体均具有较好的阳性和阴性预测价值，特别是一定程度上提高了性染色体异常的检出率。一些血清学筛查阳性结果的孕妇可能会选择进一步行无创筛查而非介入性产前诊断，但是研究表明，与核型分析相比，无创筛查会漏诊约20%的其他染色体异常病例[15、16]，包括目标染色体以外的其他染色体非整倍体和假阴性样本；即如果血清学筛查高风险而无创筛查结果正常，则染色体异常风险约为2%[15]。另外，无创筛查也无法检测B超提示异常胎儿的染色体微小缺失、重复或其他畸变，对双胎、多胎妊娠也存在一定的检测局限性。

综上所述，无创筛查只能作为一种较精确的筛查，而不能取代现行的任何其他检测项目，只有将其与遗传咨询和现有的产前筛查诊断模式很好地结合起来，才能充分发挥各自技术优势，为临床提供准确参考。

[1] De Vigan C, Baena N, Cariati E, et al. Contribution of ultrasonographic examination to the prenatal detection of chromosomal abnormalities in 19 centres across Europe[J]. Ann Genet, 2001,44(4):209-217.

[2] 刘晓亮,张媛媛,崔婉婷,等.定量荧光PCR在胎儿常见染色体非整倍体产前诊断中的应用[J].中华医学遗传学杂志,2015,32(5):635-640.

[3] Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J]. Lancet, 1997,350(9076):485-487.

[4] Chiu RW, Chan KC, Gao Y, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008,105(51):20458-20463.

[5] Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, et al. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008,105(42):16266-16271.

[6] Norton ME, Brar H, Weiss J, et al. Non-Invasive Chromosomal Evaluation (NICE) Study: results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18[J]. Am J Obstet Gynecol, 2012,207(2): 137.e1-8.

[7] Hui L, Teoh M, da Silva Costa F, et al. Clinical implementation of cell-free DNA-based aneuploidy screening: perspectives from a national audit[J]. Ultrasound Obstet Gynecol, 2015,45(1):10-15.

[8] Zhou Q, Pan L, Chen S, et al. Clinical application of noninvasive prenatal testing for the detection of trisomies 21, 18, and 13: a hospital experience[J]. Prenat Diagn, 2014,34(11):1061-1065.

[9] 林颖,孟露露,季修庆,等.血浆游离DNA高通量测序用于21-三体综合征无创产前检测[J].临床检验杂志,2013,31(1):7-8.

[10] 刘静,王华,席惠,等.新一代测序技术用于胎儿染色体非整倍体无创产前检测的研究[J].中华医学遗传学杂志,2015,32(4):533-537.

[11] Grati FR, Malvestiti F, Ferreira JC, et al. Fetoplacental mosaicism: potential implications for false-positive and false-negative noninvasive prenatal screening results[J]. Genet Med, 2014,16(8):620-624.

[12] 金玉霞,苗正友,葛加美,等.应用大规模平行基因组测序技术无创产前诊断胎儿常见染色体非整倍体异常[J].中华医学杂志,2014,94(23):1788-1790.

[13] Wang S, Huang S, Ma L, et al. Maternal X chromosome copy number variations are associated with discordant fetal sex chromosome aneuploidies detected by noninvasive prenatal testing[J]. Clin Chim Acta, 2015(444):113-116.

[14] Wang Y, Chen Y, Tian F, et al. Maternal mosaicism is a significant contributor to discordant sex chromosomal aneuploidies associated with noninvasive prenatal testing[J]. Clin Chem, 2014,60(1):251-259.

[15] Norton ME, Jelliffe-Pawlowski LL, Currier RJ. Chromosome abnormalities detected by current prenatal screening and noninvasive prenatal testing[J]. Obstet Gynecol, 2014,124(5):979-986.

[16] Davis C, Cuckle H, Yaron Y. Screening for Down syndrome-incidental diagnosis of other aneuploidies[J]. Prenat Diagn, 2014,34(11):1044-1048.

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[1] 杜贾军,孟龙,陈景寒,等.手辅助电视胸腔镜食管切除胃食管胸内吻合术[J].山东医药,2004,44(27):1-3.

[2] Takano M, Mizuno K, Okamatsu K, et al. Mechanical and structural characteristics of vulnerable plaques: analysis by coronary angioscopy and intravascular ultrasound[J]. J Am Coll Cardiol, 2002,38(1):99-104.

[3] 叶任高,陆再英.内科学[M].5版.北京:人民卫生出版社,2000:277-280.

Non-invasive common fetal chromosomal aneuploidy screening and result analysis

ZHANGYuanyuan,LIUXiaoliang,CHUGuoming,CUIWanting,HERong,ZHAOYanyan

(ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China)

ObjectiveTo explore the application value of non-invasive common fetal chromosomal aneuploidy screening.MethodsA total of 5 469 maternal peripheral blood samples were collected, and plasma free DNA was extracted for high throughput sequencing to detect fetal chromosomal aneuploidies. Samples with high risk of trisomies 21, 18, 13, X and Y were verified by multiplex quantitative fluorescent PCR (QF-PCR) and karyotype analysis by using amniotic fluid or cord blood.ResultsAfter non-invasive prenatal screening, 71 (1.3%) showed positive results, including 30 cases of trisomy 21, 7 cases of trisomy 18, 6 cases of trisomy 13, 11 cases with increased X chromosome, and 17 cases with decreased X chromosome. In trisomies 21, 18 and 13, 5 cases rejected interventional prenatal diagnosis, 3 cases were false positive, and the rest were all consistent with the results of QF-PCR and karyotyping. In positive results of sex chromosome aneuploidies, 13 cases were confirmed abnormal by karyotyping, and the accuracy rate was about 46.4%. The other 5 398 pregnant women with negative screening results were monitored by B ultrasound and were telephoned for follow-up, and none of them were found trisomies 21, 18, 13, X and Y.ConclusionsNon-invasive fetal chromosomal aneuploidy screening can accurately detect trisomies 21, 18 and 13, which can serve as a useful complement to traditional prenatal screening and diagnosis. While the accuracy of sex chromosome aneuploidies detection is low, we still need to further optimize the detection and analysis method.

chromosomal aneuploidy; prenatal screening; DNA next-generation sequencing technology; plasma free DNA

国家自然科学基金资助项目(81500242，31571198)。

张媛媛(1983-)，女，博士，助理研究员，主要研究方向为常见单基因病和染色体病的遗传学诊断。E-mail： zyy.0526@163.com

赵彦艳(1960-)，女，博士，教授，主要研究方向为心血管疾病的分子遗传学。E-mail： yyzhao@sj-hospital.org

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.001

R596.1

A

1002-266X(2017)20-0001-04

2016-04-08)