鼻腔滴注博莱霉素诱导ICR小鼠肺纤维化模型的建立

栾智华，魏砚明，刘必旺，董 立，侯 渊，王永辉

（山西中医学院，山西太原030024）

鼻腔滴注博莱霉素诱导ICR小鼠肺纤维化模型的建立

栾智华，魏砚明，刘必旺，董 立，侯 渊，王永辉

（山西中医学院，山西太原030024）

目的：通过鼻腔滴注博莱霉素诱导ICR小鼠发病，寻求建立稳定且方法简单的肺纤维化模型。方法：ICR雌性小鼠分为对照组和模型组，模型组鼻腔滴注博莱霉素50 μL（15 mg/kg），对照组滴注生理盐水。取小鼠肺组织进行HE、Masson染色、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫组化及羟脯氨酸含量测定。结果：与对照组小鼠相比，造模后第7天模型组小鼠的肺脏出现急性肺泡炎；第14天时，肺泡炎更加明显，开始出现肺纤维化；第28天时肺泡炎有所减轻，肺纤维化明显加重。第28天时模型组小鼠的肺脏HYP含量、α-SMA水平明显高于对照组。结论：鼻腔滴注博莱霉素（15 mg/kg）可诱导ICR小鼠建立相对稳定的肺纤维化模型。

肺纤维化；鼻腔；博莱霉素；ICR小鼠

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是以肺泡上皮细胞损伤、肺实质弥漫性炎性浸润、成纤维细胞异常增殖以及细胞外基质过度沉积为主要特征的一大组疾病［1］。目前IPF的病因和发病机制均不明确，所以建立稳定且方法简单的动物模型对研究肺纤维化非常重要。本文通过鼻腔滴注博莱霉素，成功诱导建立了ICR小鼠肺纤维化模型，论述如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 ICR雌性小鼠，6 w龄，体质量16~18 g，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2012-0001，给予常规颗粒饲料喂养，并自由饮水。

1.1.2 药物与试剂 注射用盐酸博莱霉素（浙江海正辉瑞制药有限公司，产品批号：15014311）；Masson染色试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号：20160317）；羟脯氨酸检测试剂盒［（碱水解法）南京建成生物工程研究所，生产批号：20160317］；鼠抗鼠 α-SMA单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；小鼠IgG免疫组化试剂盒SABC即用型（武汉博士德生物工程有限公司，生产批号：201603）；DAB显色剂（武汉博士德生物工程有限公司）；苏木素、伊红染液（北京益利精细化学品有限公司，生产批号：201560326）；无水乙醇、二甲苯、95%乙醇均为分析纯。

1.1.3 实验仪器 数显恒温水浴锅（HH-2型）；电子天平（FA3204B）；紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器 TU-1810）；石蜡切片机（YD-1508RⅢ）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9243BS-Ⅲ）；病理图文分析系统（Olympus）。

1.2 实验方法

1.2.1 肺纤维化模型复制 23只小鼠适应性饲养1 w后，按随机数字表法随机分为对照组10只，模型组13只。先用乙醚麻醉模型组小鼠，然后用微量移液器吸取50 μL博莱霉素溶液（按15 mg/kg进行干预），将药物经鼻腔缓慢滴入小鼠气管内，放入鼠笼内安置，观察其造模后一般情况，对照组经鼻腔滴注等量生理盐水。

1.2.2 检测指标 ①动物的临床症状：动物精神状态、活动情况、死亡率、体质量以及摄食饮水等。②肺组织大体观察及肺系数：造模过程中，发现小鼠死亡，打开胸腔，观察肺叶颜色、体积、有无出血点、结节等。在造模后第28天统一脱臼处死并称重记录，之后进行标本的采集，完整剥离肺组织，PBS冲洗，用吸水纸吸干多余的PBS，称得小鼠肺组织湿重其中a为肺湿重（mg），b为体质量（g）。计算小鼠的肺系数（y）。③HE和Masson染色及α-SMA免疫组化：造模过程中，发现小鼠死亡，整块切取各小鼠的左肺，以4%多聚甲醛进行固定，然后制成石蜡切片供苏木素-伊红（HE）染色、胶原纤维染色（Masson染色）、α-SMA免疫组化检测。④肺组织的羟脯氨酸（HYP）检测：将各小鼠的右肺上中叶取下放在EP管中置于-80℃保存，以完成羟脯氨酸（HYP）的检测。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 动物的临床症状表现

对照组小鼠表现正常，皮毛光亮，摄食饮水正常，呼吸平稳，体质量逐渐增加。模型组小鼠造模后活动减少，呼吸急促，反应灵敏度变差，毛发干燥晦暗，严重者可见斑秃、脱毛，进食下降，体质量逐渐减轻。模型组小鼠从第5天开始死亡，死亡率为61.5%。结果见表1，图1。

表1 小鼠的体质量变化 （g，±s）

表1 小鼠的体质量变化 （g，±s）

注：与对照组相应时间段比较，1）P＜0.01

组别 第0天 第7天 第14天 第21天 第28天对照组 22.30±0.97 23.92±1.19 25.48±1.49 26.61±1.35 26.35±1.55模型组 22.16±0.89 17.77±3.491）21.17±2.851）22.02±4.181）25.36±1.04

图1 滴注博莱霉素后小鼠体质量及存活率的变化

2.2 小鼠肺脏的肉眼观察及肺系数

对照组小鼠的肺脏无异常表现，肺叶呈淡粉红色，色泽均匀，弹性良好。模型组小鼠第7天时双肺充血水肿，可见密集的点状、弥漫性出血，体积变大；第14天双肺弹性下降，局部见大小不等点状出血，结节样改变；第28天时双肺萎缩、苍白，弹性变差，质地坚韧，表面出现灰白色结节及条索状改变。

小鼠在造模后第28天肺系数的变化情况：模型组小鼠的肺系数（13.07±0.42）明显高于对照组（7.38±0.19），差异具有统计学意义。结果见图2。

2.3 HE染色

对照组小鼠的肺泡结构清晰、完整，肺泡腔内无渗出物，无炎症细胞浸润，肺泡壁无增厚，肺泡间隔形态正常，未见增厚。

图2 滴注博莱霉素后小鼠肺脏的大体病变

模型组小鼠第7天时，肺脏出现明显的急性炎症，肺泡间隔增宽，肺泡腔内可见炎性细胞浸润，部分肺泡腔内伴有少量出血；第14天时肺泡壁结构破坏，肺泡间隔明显增宽，肺泡腔内仍有大量炎性细胞浸润，间质出现成纤维细胞增生；第28天时肺泡炎减轻，肺泡腔萎缩、消失，肺泡壁增厚，肺间质大量纤维成分沉积，肺纤维化明显加重。结果见图3。

图3 滴注博莱霉素后小鼠肺组织病理学的动态变化HE染色（×400）

2.4 Masson染色

对照组小鼠的肺泡结构正常，仅在较大的血管及气管周围有少量蓝色胶原纤维沉积。模型组小鼠第7天时蓝染部位较少；随着病情的进展，小鼠肺组织内的蓝色胶原纤维逐渐增多；第28天时模型组小鼠的肺泡结构完全被破坏，肺野内有大量蓝色胶原纤维沉积，肺泡间隔也几乎被蓝染的胶原纤维充填。结果见图4。

2.5 肺组织中α-SMA的定位

图4 滴注博莱霉素后小鼠的肺组织切片Masson染色（×400）

免疫组化结果显示：对照组小鼠的肺脏中α-SMA蛋白表达较少；第28天时模型组小鼠肺脏的α-SMA蛋白不仅表达在血管、气管的平滑肌细胞浆中，在肺间质的肌成纤维细胞浆中也有表达。结果见图5。

图5 滴注博莱霉素后小鼠的肺组织切片α-SMA免疫组化（×400）

2.6 肺组织的羟脯氨酸（HYP）的检测

小鼠在造模后第28天肺脏羟脯氨酸含量的变化情况：模型组小鼠肺脏的羟脯氨酸含量（0.63±0.02）明显高于对照组（0.31±0.01），其差异具有统计学意义。

3 讨 论

特发性肺间质纤维化（IPF）是急性或慢性间质性肺疾病中病因不明确的一种类型，肺间质和肺泡内表现为不同程度的炎症和纤维化［2］。由于该病的病因和发病机制尚不明确，目前有多种方法复制肺纤维化的动物模型来对本病进行研究。

李丽娜等［3］研究提示，对小鼠进行腹腔注射BLM 5次后，与对照组相比，模型组小鼠的肺系数、体质量变化明显，但造模时需要的BLM剂量大，注射次数多，费用偏高，故其研究受到了一定限制。本研究预实验中曾对ICR小鼠腹腔注射BLM，每只按照15 mg/（kg·d）给药，连续10 d，结果动物在注射药物后的28 d内死亡率仅为10%，表明模型不成功。张晓晔等［4］采用一次性尾静脉注射BLM ［150 mg/（kg·d）］的方法制备的肺纤维化动物模型，具有模型形成晚，动物品种特异性、死亡率高等缺点。气管注射博莱霉素是经典的给药方式，但有学者认为其形成的肺纤维化主要分布在肺门和支气管周围，故该法诱导建立的肺纤维化模型受到怀疑［5］。本研究预实验对ICR小鼠进行一次性气管注射BLM（5 mg/kg），结果动物在注射药物后死亡率非常高，表明模型不成功。

最终本研究决定采用鼻腔滴注博莱霉素的方式来建立小鼠的肺纤维化模型。通过对小鼠的临床表现、病理变化及肺脏中α-SMA表达量的观察比较发现，模型组小鼠出现精神萎靡、进食减少、脱毛，行动迟滞，呼吸急促、体质量显著减轻等症状；模型组小鼠从第5天开始死亡，28 d时死亡率为61.5%；肺脏病理切片HE、Masson染色表明，发病初期表现为肺泡炎，肺泡腔内大量炎性细胞浸润，后期肺泡炎减轻，肺组织失去了正常结构，肺泡腔萎缩，甚至消失，肺泡间隔可见大量增生的成纤维细胞，肺纤维化明显加重；α-SMA是肌成纤维细胞的表型，是其特异性分子标识［6］。与对照组相比，第28天时模型组小鼠肺组织内α-SMA表达水平明显增多。

目前测定肺脏羟脯氨酸的含量是评价肺纤维化程度的常用方法，羟脯氨酸的含量与肺纤维化成正相关［7］。实验结果显示，与对照组相比，第28天时模型组小鼠的肺脏HYP含量显著高于对照组。

综上所述，表明本研究建立的小鼠肺纤维化模型成功，从而为下一步研究奠定了坚实的基础。

［1］Raghu G，Collard H R，Egan J J，et al.An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement：idiopathic pulmonary fibrosis：evidence-based guidelines for diagnosis and management［J］.Am J Respir Crit Care Med，2011，183（6）：788-824.

［2］King T J，Pardo A，Selman M.Idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Lancet，2011，378（9 807）：1 949-1 961.

［3］李丽娜，王华，周蕾，等.博莱霉素诱导小鼠肺间质纤维化造模方式的选择［J］.中国免疫学杂志，2010，26（3）：254-257.

［4］张晓晔，宁欣，刘卫青，等.静脉注射和气管内滴入博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的差异［J］.中国实验动物学报，2008，16（3）：176-178.

［5］Lawson W E，Oury T D.Animal models of fibrotic lung disease［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2013，49（2）：167-179.

［6］Willis B C，du Bois R M，Borok Z.Epithelial origin of myofibroblasts during fibrosis in the lung［J］.Proc Am Thorac Soc，2006，3（4）：377-382.

［7］Blaauboer M E，Emson C L，Verschuren L，et al.Novel combination of collagen dynamics analysis and transcriptional profiling reveals fibrosisrelevant genes and pathways［J］.Marix Biology，2013，32（7）：424-431.

（编辑：翟春涛）

Establishment on ICR mouse model of pulmonary fibrosis induced by nasal instillation of bleomycin

Luan Zhihua，Wei Yanming，Liu Biwang，Dong Li，Hou Yuan，Wang Yonghui （Shanxi College of TCM，Taiyuan Shanxi 030024）

Objective：The pathogenesis of ICR mouse was induced by intranasal instillation of bleomycin to establish stable and simple pulmonary fibrosis model.Methods：ICR female mice were divided into control group and model group. The mice in model group were given nasal instillation of bleomycin 50 μL（15 mg/kg），the mice in control group were given nasal instillation of normal saline drip.The lung tissue of mice was observed by HE，Masson staining，the contents of alpha-SMA and hydroxyproline were detected.Results：Compared with the control group，7 days after modeling，lung tissue of the model group showed acute pulmonary alveolar inflammation.14 days after modeling，pulmonary alveolar inflammation was more obvious，and pulmonary fibrosis occurred.28 days after modeling alveolar inflammation of the model group had been reduced，pulmonary fibrosis was significantly increased.Compared with the control group，28 days after modeling the contents of HYP and alpha-SMA in the lung of the model group were significantly increased.Conclusion：Nasal instillation of bleomycin（15 mg/kg）induced ICR mice model of pulmonary fibrosis is relatively stable.

pulmonary fibrosis；nasal；bleomycin；ICR mice

R285

A

1671-0258（2017）02-0018-04

山西中医学院博士科研启动金

栾智华，高级兽医师，博士，E-mail：llzh4215@163.com

王永辉，副教授，博士，硕士生导师，E-mail：wyh766188@sina.com