转录共刺激因子对结直肠癌基质金属蛋白酶及相关蛋白的影响

潘杰　林梦心　林炳锵　徐宗斌

【摘要】 目的：探討转录共刺激因子（TAZ）对结直肠癌基质金属蛋白酶及相关增殖蛋白的影响，分析其影响结直肠癌肿瘤生物学行为的可能作用机制。方法：采用合成TAZ小干扰RNA（TAZ-siRNA）转染结直肠癌细胞株HCTT116抑制TAZ表达，检测细胞活性、侵袭迁移能力、细胞凋亡，采用实量定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测TAZ与基质金属蛋白酶mRNA表达，采用Western blot法相关蛋白表达。结果：转染组TAZ mRNA与蛋白表达均明显低于对照组与空白组（t=27.116、17.600、24.051、16.168，P<0.01）；HCT116细胞活性、侵袭迁移能力均明显低于对照组与空白组，细胞凋亡率均明显高于对照组与空白组（t=12.944、17.613、20.489、12.639、18.324、20.051，P<0.01）；基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）等mRNA表达均明显低于对照组与空白组，金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）mRNA表达均明显高于对照组与空白组（t=13.588、10.041、6.678、13.164、10.479、6.705，P<0.05或<0.01）；B细胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）蛋白表达均明显低于对照组与空白组，bcl-2相关X蛋白（bax）、细胞色素C（Cyt C）表达均明显高于对照组与空白组（t=9.358、7.670、15.205、19.163、5.937、17.063，P<0.05或<0.01）。结论：抑制转录共刺激因子（TAZ）能够抑制结直肠癌肿瘤细胞增殖与转移，可能与调节基质金属蛋白酶、相关蛋白表达水平有关。

【关键词】 结直肠癌； 转录共刺激因子； 金属蛋白酶； 增殖蛋白

Impact of Matrix Metalloprotein and Proliferin of TAZ for Colorectal Cancer/PAN Jie，LIN Meng-xin，LIN Bing-qiang，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（17）：030-033

【Abstract】 Objective：To study the effect of matrix metalloprotein and proliferin of TAZ for colorectal cancer，and analyzed possible mechanisms of colorectal cancer biological behavior.Method：Using TAZ-siRNA transfection colorectal cancer cell line HCTT116 inhibits TAZ expression，and cell activity，attack mobility，apoptosis，TAZ and matrix metal protease mRNA expression，related protein expression were tested.Result：Transfection groups TAZ mRNA and protein expression were significantly lower than those of the control group and the blank group（t=27.116，17.600，24.051，16.168；P<0.01）.HCT116 cell activity，attack mobility ability were significantly lower than those of the control group and the blank group，apoptosis rate was significantly higher than those of the control group and the blank group（t=12.944，17.613，20.489，12.639，18.324，20.051；P<0.01）.MMP-2，MMP-9 mRNA expression were significantly lower than those of the control group and the blank group，TIMP-1 mRNA expression was significantly higher than those of the control group and the blank group（t=13.588，10.041，6.678，13.164，10.479，6.705；P<0.05 or<0.01）.Bcl-2 protein expression was significantly lower than those of the control group and the blank group，bax，Cyt C expression were significantly higher than those of the control group and the blank group（t=9.358，7.670，15.205，19.163，5.937，17.063；P<0.05 or <0.01）.Conclusion：TAZ can inhibit tumor cell proliferation and metastasis of colorectal cancer，it may be related to regulating the substrate metal protease and related protein expression levels.

【Key words】 Colorectal cancer； TAZ； Matrix metalloprotein； Proliferin

First-authors address：Fujian Medical University Union Hospital，Fuzhou 350000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.17.008

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）位居肿瘤相关死亡的第3位，且发病率呈逐年上升的趋势，尽管西妥昔单抗等靶向药物不断应用于临床，但5年生存率仍不足70%[1]。结直肠癌发病机制尚未完全清楚，近期研究表明，具有PDZ结合域的转录共刺激因子（transcriptional co-activator with PDZ binding motif，TAZ）具有原癌基因特征，能促进肿瘤细胞侵袭、导致细胞癌变[2-3]，在结直肠癌组织中呈异常高表达现象[4]。有关TAZ对结直肠癌肿瘤生物学行为影响的文献报道较少，本文通过抑制结直肠癌HCT116细胞TAZ表达的方法，分析TAZ对结直肠癌基质金属蛋白酶及相关蛋白表达的影响，旨在分析其结直肠癌肿瘤生物学行为影响的可能作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 结直肠癌HCT116细胞株：福建医科大学动物实验中心；反转录试剂盒、实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）试剂盒：美国Promga公司；Trizol Lipofectamine2000转染试剂：美国Invitrogen公司；PCR引物与小干扰RNA：武汉博士德生物工程有限公司；蛋白提取试剂盒：广州健仑生物科技有限公司；凋亡染色试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司；细胞计数检测试剂盒：日本Dojindo公司；TAZ、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）、bcl-2相关X蛋白（bax）、细胞色素C（Cyt C）：美国Santa Cruz公司。癌组织标本选择2015年7-12月福建医科大学附属第一医院手术切除结直肠癌患者20例，术前均未行放化疗。

1.2 细胞培养与TAZ小干扰RNA（TAZ-siRNA）转染 常规将HCT116细胞株置入DMEM培养基（10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 mg/mL链霉素）培养。siRNA浓度调节为80 nmol/L，将细胞密度2×105/mL的HCT116细胞接种到6孔板培养24 h，参照说明书混合静置转染24 h观察转染效果。siRNA序列：TAZ：5-GCCACAUCUGGAACCUGAAGUUGAU-3；对照：5-GACGAGTTGACTGCGATTG3。

1.3 细胞活性 采用CCK-8法检测，将2×105/mL

密度HCT116细胞接种到96孔板，生长至60%～80%时转染siRNA，置于培养箱（37 ℃、5%CO2）培养48 h后，加10 μL的CCK-8孵育2 h。采用全波段酶标仪（450 nm处）测定吸光度，连续3次。

1.4 细胞侵袭迁移能力 参照王红钰等[5]文献资料，采用细胞划痕实验、Transwell小室侵袭实验测量细胞侵袭迁移能力。

1.5 细胞凋亡率 细胞转染48 h后，用磷酸盐缓冲液洗涤，调整细胞密度为5×105/mL，使用结合缓冲液（500 μL）悬浮细胞，加入10 μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和10 μL碘化丙锭混匀，孵育15 min，采用流式细胞法（FCM）测定细胞计数。

1.6 TAZ与基质金属蛋白酶mRNA表达 转录48 h后提取细胞总RNA，取2 μg逆转录合成cDNA后于RT-qPCR仪中进行PCR反应。反应条件：95 ℃ 5 min→95 ℃变性30 s→72 ℃退火30 s，共进行45个循环。通过PCR反应曲线获取阈值循环数，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参，计算相关基因表达量。各引物序列。

转移到聚偏氟乙烯膜，加入一抗、二抗孵育，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参，采用增强型化学发光试剂法检测蛋白水平变化。

1.8 统计学处理 采用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用方差分析或t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TAZ mRNA与TAZ蛋白表达 转染组TAZ mRNA与蛋白表达均明显低于对照组与空白组（P<0.01），对照组与空白组TAZ mRNA与蛋白表达比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见

2.2 TAZ-siRNA转染对HCT116细胞活性、侵袭、凋亡的影响 转染组HCT116细胞活性、侵袭迁移能力明显均低于对照组与空白组，细胞凋亡率明显高于对照组与空白组（P<0.01）。对照组与空白组细胞活性、细胞侵袭迁移能力、细胞凋亡比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.4 TAZ-siRNA转染对bcl-2等相关蛋白表达的影响 转染组bcl-2蛋白表达明显低于对照组与空白组，bax、Cyt C表达均明显高于对照组与空白组（P<0.05或<0.01）；對照组与空白组bcl-2、bax、Cyt C等表达比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

Hippo信号通路是一条高度保守的细胞生长抑制性信号通路，作为Hippo通路的主要效应分子，TAZ在组织细胞分化、发育及生长中具有重要作用[6-7]。相关研究表明，TAZ在乳腺癌细胞中过表达约20%，其表达水平与肿瘤的侵袭能力密切相关[8-9]；在MCF7、Hs578T细胞中，沉默TAZ的表达可以显著降低肿瘤细胞的转移及侵袭[10-11]；在裸鼠成瘤中，抑制TAZ的表达同样明显降低了乳腺肿瘤细胞的成瘤率[12]。曾长青等[13]研究报道，TAZ在结肠癌患者结肠癌组织表达明显高于癌旁组织，且与TNM分期、肿瘤大小、浸润深度明显相关，认为TAZ是一个潜在的结肠癌治疗靶点。

RNA干扰是双链RNA介导转录后基因沉默，可有效降解靶基因mRNA，是研究肿瘤治疗与基因功能的有效方法[14]。本研究中，采用RNA干扰技术抑制结直肠癌HCT116细胞株中TAZ的mRNA与蛋白表达，结果表明，TAZ-siRNA转染组细胞活性、侵袭迁移能力均明显低于对照组与空白组（P<0.05），细胞凋亡率明显高于对照组与空白对照组（P<0.05）。提示抑郁结直肠癌TAZ表达水平可降低肿瘤细胞活性，促进细胞细胞凋亡，王红钰等[15]也有类似的文献报道。

相关研究表明，结直肠癌肝转移与肿瘤细胞侵袭转移能力相关，其中肿瘤细胞对细胞外基质侵袭能力发挥着重要的作用[16]，文献[17-18]报道结直肠浸润边缘发现MMP-2、MMP-9、TIMP-1，其中MMP-2、MMP-9能够促进肿瘤细胞的侵袭转移，TIMP-1可抑制肿瘤细胞的侵袭转移能力[17-18]。

本研究中，抑制结直肠癌TAZ表达水平后，

TAZ-siRNA转染组MMP-2、MMP-9等mRNA表达均明显降低，TIMP-1 mRNA表达明显升高，提示抑制结直肠癌TAZ表达水平能够抑制肿瘤细胞增殖与转移。bcl-2、bax Cyt C均是调节细胞增殖凋亡的重要蛋白[19-20]，这也可以从三组bcl-2、bax Cyt C蛋白表达水平比较中得到证實。

综上所述，抑制结直肠癌TAZ表达水平有助于抑制结直肠癌肿瘤细胞的增殖与转移，可能与调节基质金属蛋白酶与相关蛋白细胞表达水平等因素有关，其具体作用机制尚待于进一步研究。

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（收稿日期：2017-05-10） （本文编辑：程旭然）