CD7抗原在急性髓系白血病微小残留病灶检测中的应用研究

栾春来 孟君霞 何孜岩 张晓南 唐广 陈杰甫 武永强

(濮阳市安阳地区医院 血液一科 河南 安阳 455000)

CD7抗原在急性髓系白血病微小残留病灶检测中的应用研究

栾春来 孟君霞 何孜岩 张晓南 唐广 陈杰甫 武永强

(濮阳市安阳地区医院 血液一科 河南 安阳 455000)

目的 研究CD7抗原在急性髓系白血病(AML)中的表达及CD7在AML微小残留病灶(MRD)检测中的意义。方法 选取安阳地区医院2012年5月至2015年6月收治的186例初发AML患者，应用流式细胞术(FCM)进行免疫表型分析，观察CD7在骨髓原始细胞中的表达情况。对于完全缓解的CD7+AML患者，将其他多种髓系抗体与CD7构成组合，进行MRD检测；对于CD7-AML完全缓解患者，根据初发免疫表型进行多种髓系抗体组合，进行MRD检测。以MRD≥1.0×10-4者计为阳性，MRD<1.0×10-4计为阴性，跟踪随访3～24个月，记录MRD值、是否复发及骨髓确诊复发时间。结果 186例AML患者中检测出51例CD7+患者，对达完全缓解的33例患者，应用FCM进行MRD追踪检测，检测到26例MRD阳性患者中的21例骨髓复发，7例阴性患者中的3例骨髓复发。CD7+组MRD阳性复发率为63.6%。CD7-组135例，对达完全缓解的90例患者应用FCM进行MRD追踪，检测到35例MRD阳性患者中的20例复发，55例阴性患者中的17例骨髓复发，CD7-组MRD阳性复发率为22.2%。CD7+组MRD阳性患者复发率比CD7-组MRD阳性患者高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 在CD7+AML患者MRD检测中，CD7抗原与其他髓系抗原组合能够很好区分正常细胞和白血病细胞。CD7抗原可以作为AML-MRD检测的重要指标，为调整AML治疗策略提供依据。

急性髓系白血病；微小残留病；CD7；流式细胞术

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一组具有不同形态学、免疫表型、细胞遗传学和分子生物学特征的异质性、克隆性造血干/祖细胞疾病。通过化疗完全缓解(CR)率达50%～80%[1]，但仍有约65%的患者最终在3～5 a内复发，提示目前的治疗方案尚不能完全清除体内的病变细胞，而这些残留的白血病细胞，即微小残留病灶(minimal residual disease，MRD)，是最终复发的根源[2-3]。 白血病细胞相关免疫表型(LAIPs)具有抗原表达混乱特征，出现某些抗原过度表达、过弱表达、不同系列抗原交叉表达以及抗原的跨阶段表达等异常表达[4]。根据此类异常表达的抗原，可应用流式细胞术(flow cytometry, FCM)区分正常的造血细胞和白血病细胞，以检测白血病MRD。研究表明，部分AML病例同时伴有淋巴系的抗原表达，CD7是最常见的一种[5]。本实验采用流式细胞术对186例初发AML患者进行免疫表型分析，观察CD7在AML中的表达特点；对于完全缓解的CD7+AML患者，将其他多种髓系抗体与CD7构成组合，进行CD7+AML患者MRD检测；对于CD7-AML完全缓解患者，根据初发免疫表型进行多种髓系抗体组合，进行MRD检测，跟踪随访3～24个月，记录MRD值、复查骨髓确诊复发时间，评价CD7在AML微小残留病检测中的意义。

1 资料和方法

1.1 临床资料 选取濮阳市安阳地区医院2012年5月至2015年6月收治的186例初发AML(除外急性早幼粒细胞白血病)患者，均符合AML诊断标准[6]。其中男89例，女97例，年龄11～82岁，中位年龄49岁。所有患者均按MICM分型诊断为AML，并根据FAB(French-American-British classification systems)进行分类。FAB分型：M1型7例，M2型96例，M4/M5型79例，M6型4例。初治时，去除姑息治疗患者，均采用DA、IA、MA、CAG等方案诱导化疗，化疗1～2个疗程达完全缓解后，巩固治疗过程中及停止治疗后对两组患者分别进行MRD检测，并随访3～24个月，对于诱导治疗不缓解患者及观察时间内骨髓确诊复发患者，不再检测MRD，MRD检测由阳性转为阴性者计入阴性。

1.2 检测方法 所有患者初诊时均进行免疫分型检测。结合患者初发的免疫分型特征，在明显异于正常髓细胞位置上出现明确的白血病细胞群，以这些残存细胞占所收集细胞总数的比例作为MRD值。对于完全缓解的CD7+AML患者，将其他多种髓系抗体与CD7构成组合，进行MRD检测；对于CD7-AML完全缓解患者，根据初发免疫表型，进行多种髓系抗体组合，进行MRD检测。仪器为贝克曼公司FC500流式细胞仪，所有荧光标记单克隆抗体及相关试剂购自贝克曼公司，采用5色荧光(荧光素分别为FITC、PE、ECD、PC50、PC7)，荧光标记方法：治疗前抽取骨髓液(肝素抗凝2 ml)，每个试管加入待测荧光抗体10 μl，骨髓细胞105～106个混匀温浴20 min，加入溶血剂，洗涤后上机，正常对照及MRD检测收集500 000个细胞。

1.3 疗效判断标准 疗效判断参照张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》[6]，根据大多数研究[7-9]等，MRD≥1.0×10-4者计为阳性，MRD<1.0×10-4计为阴性。

2 结果

2.1 AML表型分析结果及临床特征比较 186例患者中51例为CD7+AML，占27.42%。两组患者男女比例、年龄、伴有肝脾肿大比例、白细胞计数、血小板计数及骨髓原始细胞计数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组患者临床特征比较

2.2 MRD检测结果与复发的关系 51例CD7+AML患者经诱导治疗后，33例患者完全缓解，利用CD7和其他髓系抗原组合，分别于巩固治疗过程中及停止治疗后行MRD追踪检测；对MRD阳性患者进行化疗方案调整或者造血干细胞移植，并随访3～24个月。共检测出26例MRD阳性患者，其中21例最终骨髓确诊复发，其中4例转上级医院行造血干细胞移植治疗。135例CD7-AML患者经诱导治疗后，90例患者完全缓解，结合初发时免疫表型，进行多种髓系抗体组合，MRD检测及随访同CD7+组。共检测出35例MRD阳性患者，其中20例最终骨髓确诊复发，其中8例患者转上级医院。CD7+组患者MRD阳性患者复发率比CD7-组MRD阳性患者高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 CD7+组与CD7-组MRD检测结果与复发的关系[n(%)]

3 讨论

AML是一种不成熟髓系细胞克隆性恶性增生、集聚于骨髓及外周血为特点的肿瘤性疾病，其抗原表达具有很大的异质性[10]。异常表达的抗原在初发的白血病细胞中可检出，形态学完全缓解后残存的白血病细胞中和复发时的白血病细胞中仍保留抗原异常表达特征，白血病细胞的这一特征为临床微小残留病灶的检测提供了更准确的依据[11]。淋系特异性抗原CD7在髓系白血病细胞上的表达也是如此。CD7抗原是一种单链蛋白，见于胸腺细胞和NK细胞表面和大部分外周血T细胞，在单核细胞表面可有微弱表达，而粒细胞和成熟B淋巴细胞不表达。因此，在白血病免疫分型中，CD7为T系早期的一个良好标志，并用于T淋巴细胞白血病的诊断及其亚型划分[12]。文献报道CD7在初诊AML中的阳性率为10%～19%[13]，本次实验结果与之相符，另CD7+组与CD7-组患者性别、年龄、肝脾大比例、白细胞计数、血小板计数及骨髓原始细胞计数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

研究认为，诱导治疗过程中和CR后的MRD水平是一个独立的预后因素，MRD检测可以帮助及早确认复发危险性高的患者，并能判断治疗效果，监测病情变化[14]。流式细胞仪是较好的MRD检测手段，可以在单细胞水平辨认细胞的形态、大小及荧光特性，从而区别白血病细胞和正常细胞。临床发现，在诱导缓解后恢复期的AML患者骨髓细胞的抗原表达混乱[15]，利用抗原跨阶段表达或异常表达强度等特点并不能很好地区别残留的白血病细胞和正常造血细胞，然而淋巴系标志CD7在AML中的阳性表达为检测AML提供了很好的途径。本实验通过对比CD7+组AML患者与CD7-组AML经诱导治疗完全缓解的患者，利用特定的抗体组合标记，前者MRD阳性组复发率比CD7-MRD阳性组患者高，差异有统计学意义(P<0.05)，证实利用CD7与CD33、CD45或CD117等髓系标志的抗体组合可以更好地区分正常的骨髓细胞和白血病细胞，CD7抗原阳性可以作为AML-MRD检测的重要指标，为AML治疗及预后提供参考。

两组患者诱导结束后的MRD阳性率均高，随巩固治疗进行，MRD水平逐渐下降，与巩固治疗相关，另由阳性转为阴性组与调整治疗方案、治疗强度相关。CD7+组中，6例由阳性转为阴性，其中3例持续缓解，3例由阴性转为阳性复发；5例阳性患者，3例始终阳性，未复发原因可能与随访时间短，另不排除CD7抗体组合标记的细胞可能为正常克隆相关。CD7-组患者MRD阳性组复发率较低，原因考虑AML白血病细胞抗原表达紊乱及抗原漂移，不能找到合适靶抗原作为检测MRD的指标。相比较而言，对于CD7+患者，利用CD7抗体与其他髓系抗体组合标记能更好辨别白血病细胞，为AML的治疗及时提供帮助。MRD的阈值国内没有统一标准，本实验根据大多数研究，采用1.0×10-4为阈值，证实MRD阳性患者复发率明显高于MRD阴性患者，提示MRD阈值1.0×10-4可以被临床推广及使用。但任何数量的MRD均与预后相关，可能不同的时间点、不同的患者有不同的阈值，这些都由患者本身的分子生物学特性所决定。MRD阈值水平不同，所得到的研究结论亦很难进行统一的评价，这个缺陷将是FCM检测MRD在临床运用中所面临的一个重要挑战[16]。另对于MRD阴性患者，也出现临床复发，这与小部分白血病患者复发后LAIPs发生改变相关[17]，也存在MRD假阴性率，可结合初始免疫表型，找到更合适的抗体组合进行MRD检测。

总之，利用CD7与CD33、CD45或CD117等髓系标志的抗体组合可以更好地区分正常的骨髓细胞和白血病细胞，CD7抗原阳性可以作为AML-MRD检测的重要指标，为AML的治疗及预后提供参考。利用FCM检测MRD，MRD阈值、检测时间点无统一的规范及MRD的假阴性率都是需要解决的问题。

[1] Paietta E.Minimal residual disease in acute myeloid leukemia: coming of age[J] .Hematology Am SOC Hematol Educ Program,2012,2012:35-42.

[2] Bachas C,Schuurhuis G J,Assaraf Y G,et al.The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse[J].Leukemia,2012,26 (6):1313-1320.

[3] Ravandi F.Relapsed acute myeloid leukemia : why is there no standard of care[J].Best Pract Res Clin Haematol,2013,26(3):253-259.

[4] Campana D,Pui C H.Detection of minimal residual disease in acute leukemia: methodological advances and clinical significance[J].Blood,1995,85(6):1416-1434.

[5] Buccisano F,Maurillo L,Del Principe M I,et al. Prognostic and therapeutic implications of minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia[J].Blood,2012,119(2):332-341.

[6] 张之南,沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].第3版.北京:科学出版社,2007:106 -115.

[7] Rossi G,Minervini M M,Carella A M,et al.Comparison between multiparameter flow cytometry and WT1-RNA quantification in monitoring minimal residual disease in acute myeloid leukemia without specific molecular targets[J].Leuk Res,2012,36(4):401-406.

[8] Leung W,Pui C H,Coustan-Smith E,et al.Detectable minimal residual disease before hematopoietic cell transplantation is prognostic but does not preclude cure for children with very-high-risk leukemia[J].Blood,2012,120(2):468-472.

[9] Loken M R,Alonzo T A,Pardo L,et al.Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia:a report from the Children’s Oncology Group[J].Blood,2012,120(8):1581-1588.

[10]李耀华,徐娟,孙雪静,等.CD7在成人急性髓系白血病的表达及其在微小残留病检测中的应用[J].首都医科大学学报,2006,27(2):233-236.

[11]张静,孙玲,孟小莉,等.诱导化疗期间行微小残留白血病检测在急性髓系白血病预后判断中的价值[J].中国实用医刊,2014,41(13):65-66.

[12]万岁桂,赵弘,孙雪静,等.多参数流式细胞术对急性髓系白血病微小残留病变与疾病复发的监测[J].中国实验血液学杂志,2009,17(3):557-562.

[13]许晓东,胡翠华,常乃柏,等.成人急性髓细胞白血病免疫分型特点及临床预后分析[J].中国实验诊断学,2010,14(3):423-426.

[14]刘斌,李睿,吴辉菁,等.急性白血病Ly+AML型和My+ALL型预后因素的临床研究[J].中国实验血液学杂志,2007,15(2):421-424.

[15]San Miguel J F,Martinez A,Macedo A,et al.Immunophenotypings investigatinon of minimal residual disease is a useful approach for perdiction relapse in acute myeloid leukemia patients[J].Blood,1997,90(6):2465-2470.

[16]Al-Mawali A,Gillis D,Lewis I.The use of receiver operating characteristic analysis for detection of minimal residual disease using five-color multiparameter flow cytometry in acute myeloid leukemia identifies patients with high risk of relapse[J].Cytometry B Clin Cytom,2009,76(2):91-101.

[17]Li X,Du W,Liu W,et al.Comprehensive flow cytometry phenotype in acute leukemia at diagnosis and at relapse[J].APMIS,2010,118(5):353-359.

Application of CD7 antigen in detection of minimal residual disease of acute myeloid leukemia

Luan Chunlai, Meng Junxia, He Ziyan, Zhang Xiaonan, Tang Guang, Chen Jiefu, Wu Yongqiang

(Anyang District Hospital, AnYang 455000, China)

Objective To study the expression of CD7 antigen in acute myeloid leukemia (AML) and the significance of CD7 in detection of AML minimal residual disease (MRD). Methods One hundred and eighty-six cases of newly diagnosed AML were collected from May of 2012 to June of 2015 in Anyang District Hospital, and immunophenotyping was performed by flow cytometry (FCM). The expression of CD7 antigen in bone marrow primitive cells was observed. For CD7+AML patients with complete remission, a variety of other myeloid antibodies were combined with CD7 to detect the MRD. And for CD7-AML patients with complete remission, according to the initial immunophenotype, a variety of myeloid antibodies were combined to detect the MRD. MRD≥1.0×10-4was positive, MRD<1.0×10-4was negative. All patients were followed up for 3～24 months, and MRD value, whether recurrence and recurrence time accrording to bone marrow were recorded. Results A total of 51 patients with CD7+were detected in 186 patients with AML. Among the 33 patients with complete remission, 21 cases of bone marrow recurrence were detected in 26 cases of MRD positive patients using FCM，and 3 cases of bone marrow recurrence in 7 cases of negative patients. MRD positive recurrence rate was 63.6% in the CD7+group. Among the 135 patients in the CD7-group, using FCM to track the MRD，90 cases were complete remission, and 20 cases of bone marrow recurrence were detected in the 35 cases of MRD positive patients. 17 cases were detected as bone marrow recurrence in 55 cases of MRD negative. In the MRD+group, the recurrence rate was 22.2%. The relapse rate of CD7+group was significantly higher than the corresponding group (P<0.05). Conclusion In the detection of MRD of CD7+AML patients, CD7 antigen combined with other myeloid antigen can distinguish between normal cells and leukemia cells, and it can be used as as an important index for MRD detection，provide the basis for adjustment of AML treatment strategies.

acute myeloid leukemia;minimal residual disease;CD7;flow cytometry

濮阳市科技计划项目(130638)。

栾春来，E-mail：luan11_21@163.com。

R 544.1

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.11.003

2017-01-24)