超声造影定量分析失血性休克复苏期肝血流灌注变化的实验研究

魏 芳

何晶玲2HE Jingling

龙春艳2LONG Chunyan

段琬璐2DUAN Wanlu

王莎莎2WANG Shasha

李叶阔1,2LI Yekuo

超声造影定量分析失血性休克复苏期肝血流灌注变化的实验研究

魏 芳1,2WEI Fang

何晶玲2HE Jingling

龙春艳2LONG Chunyan

段琬璐2DUAN Wanlu

王莎莎2WANG Shasha

李叶阔1,2LI Yekuo

中国医学影像学杂志

2017年 第25卷 第6期：409-413

Chinese Journal of Medical Imaging 2017 Volume 25 (6): 409-413

目的探讨超声造影（CEUS）定量监测失血性休克（HS）复苏期肝实质血流灌注变化的价值。材料与方法45只实验兔标号后平均分为5组，其中1 组作为正常对照组，其余4 组均采用Wiggers改良法建立可逆性HS模型。模型组中1 组作为休克组，其余3组采用胶体液（羟乙基淀粉）对动物模型进行复苏治疗，并标号后设定为复苏1 h组、复苏4 h组和复苏24 h组。各组实验兔均采动脉血检测血乳酸（LAC），同时行CEUS检查，生成时间-信号强度曲线（TIC）并进行定量分析。实验结束后处死实验兔，取肝组织进行病理检查。结果与正常对照组比较，休克组到达时间（AT）、达峰时间（TTP）明显延长，峰值强度（PI）、曲线下面积（AUC）减低，差异有统计学意义（P＜0.05）；复苏1 h组PI、AUC增加，AT减低，差异有统计学意义（P＜0.05）；复苏4 h组和24 h组PI、AUC增加，AT、TTP减低，差异无统计学意义（P＞0.05）。与休克组比较，复苏1 h组PI、AUC增加，AT减低，差异有统计学意义（P＜0.05）；复苏4 h组和24 h组间各参数差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论CEUS可定量评价HS复苏期肝实质血流灌注的改变，对临床治疗具有一定的参考价值。

休克，出血性；超声检查，多普勒，彩色；造影剂；复苏术；肝；血液灌注；微循环；疾病模型，动物；兔

失血性休克（hemorrhagic shock，HS）发生后，为保证脑、心等重要器官血流，肝血流灌注会减低，肝细胞对缺血缺氧敏感，易导致肝功能异常，甚至出现衰竭。液体复苏是抗休克治疗的重要手段[1-2]。为避免器官发生隐匿性缺血，掌握复苏期各器官微循环灌注特征具有重要意义。前期研究显示，CEUS可成功评价不同HS等级的动物模型肾血流灌注改变[3]。本研究拟在此基础上建立HS液体复苏动物模型，探讨CEUS定量分析技术对HS液体复苏期肝微循环血流灌注变化的监测价值。

1 材料与方法

1.1 动物模型 健康新西兰大耳白兔45 只[广州军区广州总医院动物实验中心提供，许可证号：SYXK（粤）2014-0100]，体重（2.72±0.41）kg，雌雄不限。在动物实验中心室温下喂养，自由饮食。实验开始前12 h禁食，自由饮水。实验兔经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠按 0.1 ml/kg进行麻醉、备皮，取仰卧位固定于动物板。经耳缘静脉置入22G留置针作为注射通道。动物仰卧固定后消毒颈部皮肤，剪约2 cm的正中切口，暴露颈总动脉，连接三通管并结扎、固定。采用Wiggers改良法复制兔可逆性休克模型，左侧颈总动脉放血速度为2 ml/（kg·min），使平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）降至（39.1±2.8） mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），放血量为（69.0±7.2） ml，维持 60 min 后对兔进行液体复苏，补液时间与放血时间保持一致[4-6]。整个复苏过程限定于90 min内，MAP（67.0±2.4）mmHg为复苏成功。

1.2 仪器与试剂 采用彩色多普勒超声诊断仪（GE公司Logiq-E9，9L-D探头，频率为6～9 MHz），配备造影成像及定量分析技术；心电监护仪（广州索诺星信息科技有限公司，型号SM-500S），配备有创血压测量压力传感器；输液泵（珠海市美瑞华医用科技有限公司，型号MR-508）。声诺维（SonoVue）六氟化硫微泡冻干粉剂；肝素钠注射液（江苏万邦生化医药股份有限公司）； 戊巴比妥钠（中国医药集团上海化学试剂公司）；羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液（辽宁海神联盛制药有限公司，规格250 ml）。

1.3 实验方法 将45 只实验兔标号后随机平均分为5组，其中1 组作为正常对照组，其余4 组均采用Wiggers改良法建立可逆性HS模型。模型组中1 组作为休克组，其余3 组采用胶体液（羟乙基淀粉）对动物模型进行复苏治疗，并标号后设定为复苏1 h、4 h和24 h组。各组均采动脉血检测血乳酸（lactate acid，LAC），同时行CEUS检查，生成时间-信号强度曲线（time-intensity curve，TIC）进行定量分析。实验结束后处死实验兔，取肝组织进行病理检查。

1.4 造影方法与观察指标 彩色多普勒超声诊断仪参数设定为：输出功率10%，动态范围54 dB，机械指数0.14，增益90%，聚焦深度2～3 cm。使用前用生理盐水5 ml溶解造影剂冻干粉，振荡混匀后采用团注法经耳缘静脉注射SonoVue混悬液0.10 ml/kg[7]。随后用2 ml生理盐水冲管。团注造影剂计时并记录动态图像，2次造影间隔＞15 min。选取右肋缘下肝最大切面，尽量避开肋骨，固定切面观察造影90 s。检查结束后，使用数字化医学成像及传输（digital imaging and communication in medicine，DICOM）格式记录肝灌注各个时间点的数据。使用 TIC-Analysis（GE，America）软件包进行定量分析，感兴趣区（ROI）设置为直径3 mm的圆形取样框，放置在与声束垂直的肝右叶中心部位实质，观察ROI内各像素及造影剂微泡回声量的变化，经过伽马拟合F（t）=AtCexP（－kt）+B获得肝灌注TIC及相关定量参数，包括到达时间（arrival time，AT）、达峰时间（time to peak，TTP）、峰值强度（peak intensity，PI）、曲线下面积（AUC）。

1.5 统计学方法 采用 SPSS 20.0 软件，计量资料以±s表示，采用重复测量方差分析比较各组灌注参数，组间两两比较采用LSD法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型 建模的36 只大白兔中，2 只死于麻醉过量，1 只死于休克，33 只均成功建模。平均输液量（89.0±24.3）ml，平均输液时间（59.8±8.3）min。

2.2 生理指标 与正常对照组相比，休克组MAP、指脉氧、体温显著下降，呼吸、心率加快；复苏后上述指标逐渐恢复。与休克组相比，复苏后MAP、指脉氧逐渐上升，复苏4 h后体温逐渐上升，差异有统计学意义（P＜0.05），呼吸、心率下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

2.3 实验室检查 休克组LAC较正常对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），复苏后呈逐渐降低趋势。与正常对照组比较，复苏1、4 h组LAC差异有统计学意义（P＜0.05），复苏24 h组差异无统计学意义（P＞0.05）。各组与休克组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 1。

2.4 超声造影 团注造影剂后，可实时观察到数秒内造影剂信号由粗大的肝动脉迅速到达肝实质，随后数秒造影剂又经门静脉到达肝实质，双重血供使肝实质快速呈现均匀明显增强。休克时，肝的血流锐减，血管明显变细，造影剂呈絮状聚集于血管腔内，扩散缓慢，TTP及廓清时间延长，PI降低。复苏后，肝实质增强水平逐渐恢复。正常肝实质灌注曲线可见到3个时期，即基线段、缓慢上升段和平台段，反映造影剂微泡在肝内微循环灌注的渡越过程（图2A）。在休克状态下，TIC上升较前缓慢，TTP延迟，PI降低（图2B）。随复苏时间的延长TIC逐渐恢复（图2C～E）。

表1 不同状态下各组实验兔基本情况及生理指标比较（±s）

表1 不同状态下各组实验兔基本情况及生理指标比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与休克组比较，#P＜0.05

分组 动物数（只） 体温（℃） 平均动脉压（mmHg） 心率（次/分） 呼吸（次/分） 指脉氧（%）正常对照组 8 38.12±0.74 91.37±7.32 241.62±10.19 38.75±4.16 94.62±2.38休克组 8 35.58±1.49* 37.62±2.56* 253.75±17.27 47.50±11.42 73.62±5.52*复苏 1 h 组 8 35.23±0.72* 67.50±2.39#* 240.75±23.21 45.12±4.21 91.50±2.26#复苏 4 h 组 9 35.92±0.69* 68.75±1.82#* 244.50±17.17 43.75±6.82 90.37±2.66#复苏 24 h 组 9 37.92±0.68# 69.25±2.37#* 244.50±17.92 42.00±8.48 91.75±3.28#F值 17.505 195.474 0.684 1.173 47.51P值 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.01

图1 不同状态下各组LAC水平比较。与休克前比较，*P＜0.05；与休克期比较，#P＜0.05

与休克组比较，正常对照组AT、TTP明显缩短，PI、AUC增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与复苏1 h组比较，PI、AUC 和 AT 差异均有统计学意义（P＜0.05），TTP差异无统计学意义（P＞0.05）；与复苏4 h组、24 h组比较，各参数差异均无统计学意义（P＞0.05）。休克组与复苏1 h组比较，PI、AUC和AT差异有统计学意义（P＜0.05），TTP差异无统计学意义（P＞0.05）；与复苏4 h组、24 h组比较，各参数差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

图2 各组肝脏TIC。正常肝脏TIC，显示造影剂的渡越过程（A）；休克状态下肝脏TIC（B）；复苏1 h肝脏TIC（C）；复苏4 h肝脏TIC（D）；复苏24 h肝脏TIC（E）

2.5 组织学结果 正常状态下，肝小叶结构完整，小叶中可见中央静脉，肝板结构排列规则，肝细胞未见水肿及坏死样病理改变（图3A）。休克后，肝小叶结构基本完整，肝细胞明显肿胀，可见空泡结构，血窦中明显充血，肝细胞体积明显变大，但无肝细胞坏死样改变，也无假小叶形成（图3B）；复苏1 h后，肝细胞有轻微水肿样改变，小叶中偶见点状坏死区域，周围可见少量炎症细胞浸润（图3C）；随着复苏时间的推进观察至24 h，肝细胞偶见轻微水肿变性，呈空泡样结构，未见明显充血和坏死样改变（图3D、E）。

表2 不同状态下CEUS观察兔肝实质定量参数（±s）

表2 不同状态下CEUS观察兔肝实质定量参数（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与休克组比较，#P＜0.05；PI：峰值强度；TTP：到达时间；AUC：曲线下面积；AT：到达时间

分组 动物数（只） PI（dB) TTP（s） AUC（dBs） AT（s）正常对照组 8 28.62±1.77# 13.56±1.79# 1342.84±214.15# 6.53±0.72#休克组 8 21.58±2.02* 20.68±3.34* 815.15±142.35* 10.72±1.19*复苏 1 h 组 8 25.20±2.29*# 16.33±1.22 1030.92±110.99*# 7.53±0.64#复苏 4 h 组 9 29.32±0.93# 13.12±1.07# 1281.28±154.96# 6.74±0.55#复苏 24 h 组 9 30.35±1.36# 12.18±0.95# 1273.25±121.84# 5.94±0.80#F值 34.055 26.469 16.701 43.487P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

图3 各组肝组织切片（HE，×200）。A.正常对照组；B.休克后肝细胞内空泡样结构（箭头），血窦内明显充血（箭）；C.复苏1 h后，偶见少量点状坏死（箭）；D.随着复苏的进展，复苏4 h 组病理镜下仅偶见肝细胞水肿（箭）；E.复苏24 h组

3 讨论

HS的转归与组织灌注密不可分[8]。外科患者围术期液体治疗专家共识中指出，HS发生后，低灌注的程度在各个器官并不一致，随着液体复苏治疗心率和血压逐渐恢复正常，全身血流量增加，血液再次重新分布，仍可能存在某个或某些器官的低灌注，处于“隐匿性休克”状态，导致相应器官出现功能障碍[9]。因此，临床上需要注意识别此类情况，避免隐匿性低血容量和组织低灌注的发生。目前的影像检查手段包括CT、MRI灌注成像、核素显像可评估组织血流灌注，但均存在仪器体积庞大、移动不便、不适宜床边检测等不足。超声具有便捷、安全、无辐射和重复性好等优点，更适用于床旁检查、重症监护以及院前急救[10]。

肝脏是双重供血的器官，肝动脉供血量约占肝总供血量的1/3，门静脉供血量较大，约占2/3。本研究结果显示，HS状态肝微循环灌注明显改变。HS状态下，心脏收缩能力加强，血液重新分布，以保证重要生命器官心、脑的血液供应[11]。随时间推移，肝动脉缓冲效应功能减退，甚至丧失，局部肝组织微循环的血流动力学发生改变，致使肝血窦阻力逐渐增加，出现肝内门-体分流，即肝的部分血流通过末端小动静脉间的直接通路而不是通过肝的毛细血管网，最终导致肝血流灌注急剧减少，灌注速度减慢[12]。因此，CEUS表现为AT、TTP延长，PI明显减少，AUC急剧减少。

CEUS定量检测结果表明，静脉滴注胶体液后，肝微循环灌注逐渐恢复正常。随着胶体液的输入，外周循环血流量不断增加，外周阻力降低，血管壁上平滑肌松弛，小血管及毛细血管扩张，肝动脉缓冲效应发挥调节作用。注入造影剂后，表现为肝实质的微循环灌注逐渐恢复。与休克组比较，复苏1 h组PI、AUC增加，AT减低，其原因可能为限制性液体复苏方式扩充血容量较慢，而机体自身代偿机制尚未补给，短时间内肝微循环未能完全恢复。随着复苏时间推进，复苏4 h及24 h组PI、AUC增加，AT、TTP减低，各参数逐渐向正常恢复。以上结果提示，PI、AT及TTP发生改变时均可引起AUC的显著改变，表明AUC为反映血流灌注的敏感指标，与Lucidarme等[13]的研究结果一致。因此，液体复苏可有效地改善组织灌注，降低组织耗氧，减轻由于组织缺氧引起的细胞水肿，这与病理结果相符。

本研究结果证实，HS状态LAC水平明显升高，输液复苏后逐渐降低直至恢复正常。LAC是体内糖酵解的特异性代谢产物，能直接反映无氧代谢和组织氧合代谢情况，是组织供氧不足的可靠指标。本研究结果与文献报道[14]一致。

本研究尚存在一些不足，血液检测均使用人体检测的试剂及参考标准，将其运用于动物结果可能会有一定的误差。休克的临床病理生理改变复杂，实验中取得的数据较为单一、样本量不足，有待积累更多的动物及临床经验。

总之，CEUS通过定量分析及时检测到休克及复苏前后肝微循环血流灌注的变化，这与LAC变化一致，是对以往采用肝酶等方法来评估肝损伤程度的补充。部分灌注参数可以作为敏感、有效的监测指标，进一步评估休克患者的病情变化及治疗效果，为临床在HS诊断和治疗方面提供一种新的无创性检查方法。

[1]Spahn DR, Bouillon B, Cerny V, et al. Management of bleeding and coagulopathy following major trauma: an updated European guideline. Crit Care, 2013, 17(2): R76.

[2]Finfer S, Bellomo R, Boyce N, et al. A comparison of albumin and saline for fl uid resuscitation in the intensive care unit. N Engl J Med, 2004, 350(22): 2247-2256.

[3]刘锐洪, 李叶阔, 孙彬录, 等. 超声造影定量分析急性失血性休克肾血流灌注的实验研究. 中国医学影像学杂志,2015, 23(9): 641-644.

[4]Lomas-Niera JL, Perl M, Chung CS, et al. Shock and hemorrhage: an overview of animal models. Shock, 2005,24(Suppl 1): 33-39.

[5]Driessen B, Jahr JS, Lurie F, et al. Arterial oxygenation and oxygen delivery after hemoglobin-based oxygen carrier infusion in canine hypovolemic shock: a dose-response study.Crit Care Med, 2003, 31(6): 1771-1779.

[6]陈孝平. 外科常用实验方法及动物模型的建立. 北京: 人民卫生出版社, 2005: 97-99.

[7]李杰, 董宝玮, 于晓玲, 等. 肝不同部位灰阶超声造影定量分析的实验研究. 中华超声影像学杂志, 2004, 13(6): 460-462.

[8]Cottingham CA. Resuscitation of traumatic shock: a hemodynamic review. Adv Crit Care, 2006, 17(3): 317-326.

[9]中华医学会外科学分会. 外科病人围手术期液体治疗专家共识(2015). 中国实用外科杂志, 2015, 35(9): 960-966.

[10] Schneider A, Johnson L, Goodwin M, et al. Bench-to-bedside review: contrast enhanced ultrasonography--a promising technique to assess renal perfusion in the ICU. Crit Care, 2011,15(3): 157.

[11] Bonanno FG. Hemorrhagic shock: the "physiology approach".J Emerg Trauma Shock, 2012, 5(4): 285-295.

[12] 刘志坤, 谢文彪. 肝动脉缓冲效应: 机制及临床意义. 国外医学: 外科学分册, 2005, 32(6): 416-419.

[13] Lucidarme O, Franchi-Abella S, Correas JM, et al. Blood fl ow quantification with contrast-enhanced US: "entrance in the section" phenomenon--phantom and rabbit study. Radiology,2003, 228(2): 473-479.

[14] 李大鹏, 王永清, 张永军, 等. 创伤性失血性休克大鼠血乳酸水平动态测定及其临床价值推定. 实用医药杂志, 2015,32(9): 831-833.

（本文编辑 闻 浩）

Quantitative Analysis of Hepatic Perfusion During Resuscitation After Hemorrhagic Shock by Contrast-enhanced Ultrasound

PurposeTo investigate the value of contrast-enhanced ultrasound (CEUS) in monitoring hepatic parenchymal perfusion quantitatively during resuscitation after hemorrhagic shock (HS).Materials and MethodsForty-five labeled rabbits were randomly divided into fi ve groups. One group was normal control group, and the other four groups were established reversible HS modes by using modi fi ed Wiggers method. In the four model groups, one group was chosen as the shock group, and the other three groups

colloid (hydroxyethyl starch) for resuscitation. The three resuscitation groups were named as 1 h group, 4 h group, 24 h group according to resuscitation time. The arterial blood was collected for testing blood lactic acid (LAC) in each group. The CEUS was performed to form time-intensity curve (TIC) for quantitative analysis. At the end of the experiment, the rabbits were sacri fi ced and the liver tissues were examined for pathology.ResultsCompared with the normal control group, the arrival time (AT) and time to peak(TTP) of the shock group were signi fi cantly prolonged, and the peak intensity (PI) and area under curve (AUC) of the shock group decreased, all with significant difference (allP＜0.05); in the 1 h resuscitation group, the PI and AUC increased, and the AT decreased,all with signi fi cant difference (allP＜0.05); in the 4 h and 24 h resuscitation group, the PI and AUC increased, and the AT and TTP decreased, but all without signi fi cant difference(allP＞0.05). Compared with the shock group, the PI and AUC of the 1 h resuscitation group increased, and the AT of 1 h resuscitation group decreased, all with significant difference (allP＜0.05); all the tested parameters of the 4 h and 24 h resuscitation group were significant different (P＜0.05).ConclusionCEUS can quantitatively evaluate the changes of hepatic parenchymal perfusion during HS resuscitation, which has a certain reference for clinical treatment.

Shock, hemorrhagic; Ultrasonography, Doppler, color; Contrast media;Resuscitation; Liver; Hemoperfusion; Microcirculation; Disease models, animal; Rabbits

1.南方医科大学 广东广州 510000

李叶阔

全军医学科研“十二五”计划课题项目

（2014A020212255）；广东省自然科学基金项目（2016A030313611）。

R445.1；R575

2016-12-01

10.3969/j.issn.1005-5185.2017.06.003

2017-02-07

2. 中国人民解放军广州总医院超声科 广东广州 510010

1.Sourthern Medical University, Guangzhou 510000, China; 2.Department of Ultrasound,General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA, Guangzhou 510010, China

Address correspondence to:LI Yekuo

E-mail: yekuoli@163.com

（CWS12J076）；广东省科技计划项目