人咬肌内注射A型肉毒毒素后组织形态学观察

朱顺文 王君 马昊 徐国栋 马福顺

人咬肌内注射A型肉毒毒素后组织形态学观察

朱顺文1王君1马昊2徐国栋2马福顺1

目的 观察人咬肌内注射A型肉毒毒素后咬肌纤维的组织形态学改变。方法 自2011年4月至2015年10月，收集60例双侧下颌骨肥大伴咬肌肥大患者的左侧和右侧咬肌标本，共120份。将60份未注射A型肉毒毒素的咬肌标本作为对照组，60份已注射A型肉毒毒素的咬肌标本作为实验组。两组标本均行石蜡切片和HE染色，光镜下观察两组咬肌纤维的基本结构，测量其横截面面积，并进行统计学分析。结果 光学显微镜观察，未发现两组咬肌纤维的基本结构发生改变，两组咬肌纤维横截面面积的差异具有统计学意义（P＜0.05）。咬肌纤维横截面面积在第12周时减小程度最大，之后减小趋势放缓，第24周时，与第12周时的面积基本一致。结论 A型肉毒毒素能诱导人咬肌萎缩，在注射后第12周时萎缩程度最大，之后无明显变化。

A型肉毒毒素；咬肌肌纤维；咬肌肥大；肌纤维横截面面积

良性咬肌肥大是一种尚未明确具体发病机制的常见临床现象[1]。其以下颌角区及附近软组织膨大，伴或不伴有局部疼痛为特点[2]，严重肥大者可导致面部轮廓畸形、不对称。当前良性咬肌肥大的临床治疗方式有手术治疗、药物治疗、射频治疗等，但各有优缺点。A型肉毒毒素的咬肌内注射治疗通常被认为是一种有效、安全性高、不良反应小的低侵袭性疗法[3]，被广泛应用于临床。潍坊医学院收集60例双侧下颌骨肥大伴咬肌肥大患者的咬肌标本，观察并分析了人咬肌内注射A型肉毒毒素后咬肌肌纤维的组织形态学改变。现报道如下。

1 实验材料

1.1 标本来源 咬肌标本来源于自2011年4月至2015年10月行口内入路下颌骨咬肌部分切除术的60例双侧下颌骨肥大伴咬肌肥大患者，共120份（每例患者左、右侧各留取标本1份）。男性7例（14份），女性53例（106份）；年龄17～48岁，平均（23.5±5.5）岁。标本的采集部位为近咬肌粗窿1/3处深层咬肌，切取标本量至保留该区域1/3～1/2咬肌，切取的咬肌标本均在术后经4%中性缓冲甲醛液及时固定。全部患者均无其他疾病，且均获得患者的知情同意。

1.2 试剂与仪器 4%中性缓冲甲醛液、二甲苯、乙醇、中性树胶封片剂、HE染色试剂盒均购自北京索莱宝公司；A型肉毒毒素购自中国兰州生物制品研究所；Leica EG1150H石蜡包埋机、Leica RM2255石蜡切片机（德国LEICA公司）；Olympus BX-51正置光学显微镜、Olympus DP73数码照相机、Cell Sens Dimension图像分析系统（日本OLYMPUS公司）。

2 实验方法

2.1 实验分组 将未行A型肉毒毒素注射治疗的患者作为对照组，已行A型肉毒毒素注射治疗的患者作为实验组，每组60份。实验组中，根据患者最后一次注射A型肉毒毒素距手术取材的间隔时间分为4、8、12、16和24周组。两组咬肌标本均在相同条件和环境下，行石蜡切片、HE染色及组织形态学观察，并对各组咬肌肌纤维的横截面面积进行测量及收集数据。

2.2 咬肌石蜡切片及HE染色 取出经4%中性缓冲甲醛液固定的咬肌，将咬肌标本平置于取材板上，横切一块大小约为0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的咬肌。将切好的咬肌标本用纱布袋包裹，流水冲洗12 h[4]，再经70%、80%、90%、95%、100%乙醇由低浓度至高浓度的顺序分别脱水1 h，经二甲苯透明后，将咬肌标本置于石蜡包埋机中浸蜡，最后经石蜡包埋冷却后制备成石蜡组织块。将石蜡组织块置于冰上及时进行连续切片（切片厚度为4 μm），每个石蜡组织块制作3张石蜡切片，每张切片进行HE染色。

2.3 测量咬肌肌纤维的横截面面积 全部石蜡切片在相同条件和环境下经过HE染色后，用Olympus BX-51正置光学显微镜观察，采用Cell Sens Dimension图像分析系统软件测量两组咬肌肌纤维的横截面面积。选取每例患者左侧和右侧咬肌标本中染色效果好且视野清晰的切片，400倍光学显微镜下随机取5个视野，测量每个视野内全部咬肌肌纤维的横截面面积，取其平均值。

2.4 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。两组咬肌肌纤维横截面面积的数值均以±s表示，两组的差异比较采用U检验，实验组不同时间取材间隔的左侧和右侧咬肌肌纤维横截面面积的整体比较均采用多因素方差分析，实验组组间比较采用snk-q检验，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 两组咬肌肌纤维的变化 经Cell Sens Dimension彩色图像分析系统软件分析后，显示实验组较对照组咬肌肌纤维横截面面积明显减小。两组数据进行统计学分析，肌纤维横截面面积的差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组咬肌肌纤维的横截面积 μm2

3.2 HE染色组织学观察 实验组与对照组的咬肌肌纤维相比，明显减小。两组咬肌肌纤维均具有高度相似的基本组织结构，且肌纤维排列整齐，咬肌肌纤维细胞均结构完整，未见变性、水肿、坏死等病理改变（图1）。

3.3 A型肉毒毒素注射4、8、12、16、24周后咬肌肌纤维横截面面积的变化 注射A型肉毒毒素后，人咬肌肌纤维的横截面面积会发生不同程度的减小。随着时间的推移，咬肌肌纤维的减小程度逐渐增大，第12周时最大，此后减小趋势逐渐平缓;第24周时，咬肌肌纤维横截面稍有增大;但与第12周相比，差异无统计学意义（P＞0.05，图1）。实验组不同时间间隔的咬肌肌纤维横截面面积的整体比较，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。实验组组间数据的分析比较发现，第4周与第8周、第12周与第16周、第16周与第24周右侧咬肌肌纤维横截面面积的差异无统计学意义（snk-q和P值分别为3.75和0.17、9.33和0.06、3.22和0.22）；第8周与第12周右侧咬肌肌纤维横截面面积的差异有统计学意义（snk-q值为22.35，P＜0.05）；第4周与第8周、第12周与第16周、第16周与第24周左侧咬肌肌纤维横截面面积的差异无统计学意义（snk-q和P值分别为4.23和0.15、7.66和0.06、2.77和0.26）；第8周与第12周左侧咬肌肌纤维横截面面积的差异有统计学意义（snk-q值为20.58，P＜0.05），见图2。

表2 实验组不同间隔标本的咬肌肌纤维横截面面积

4 讨论

图1 两组人咬肌肌纤维的HE染色（×400） a.对照组 b.实验组A型肉毒毒素注射后4周 c.实验组A型肉毒毒素注射后8周 d.实验组A型肉毒毒素注射后12周 e.实验组A型肉毒毒素注射后16周 f.实验组A型肉毒毒素注射后24周

图2 实验组咬肌肌纤维横截面面积的变化

良性咬肌肥大的临床治疗方法多种，以手术切除、药物注射治疗、射频治疗为主。由于手术切除肥大咬肌后会给患者留下切口创伤以及瘢痕[5]，且在手术过程中，还可能造成神经、血管损伤，导致血肿、感染等并发症发生，常令患者难以接受。Huang等[6]研究认为，射频治疗咬肌肥大的效果显著，但局限于射频治疗适应证的选择较为严格，且治疗技术尚不成熟，不能在临床上大范围推广。A型肉毒毒素注射治疗具有有效率高、不良反应小等优点，得到了患者的普遍认可。1980年，AB Scott将A型肉毒毒素应用于眼肌痉挛的治疗。1992年，JD Carruthers和JA Carruthers首次将A型肉毒毒素应用于眉间区皱纹的美容治疗。1994年，AP Moore和GDWddo将A型肉毒毒素用于治疗良性咬肌肥大。近年来，国内外学者将A型肉毒毒素应用于治疗咬肌肥大、腓肠肌肥大等良性骨骼肌肥大，并取得了满意的效果[7-9]。

目前，国内外学者的研究多集中在A型肉毒毒素的临床治疗观察上，对于注射A型肉毒毒素后组织形态学的观察也是以动物为研究对象而进行的研究[10]。由于动物跟人类的解剖和功能差异较大，不能真实地反映A型肉毒毒素注射后对人咬肌的影响，研究结果具有一定的局限性。因此，进行以人咬肌为研究对象的研究很必要。本研究以人咬肌为研究对象，观察人咬肌内注射A型肉毒毒素后，咬肌肌纤维横截面面积的改变情况，以及分析了A型肉毒毒素注射时间的不同对人咬肌肌纤维的影响。A型肉毒毒素是由厌氧型肉毒梭状芽孢杆菌产生的高强效神经毒素，通过作用于运动神经末梢肌肉接头处，裂解破坏此处的膜联系/跨膜蛋白[11]，阻断神经递质乙酰胆碱的释放和神经冲动的传导，引起肌肉松弛性麻痹，导致肌肉萎缩。研究过程中发现，在A型肉毒毒素注射12周后，其诱导咬肌肌肉萎缩作用出现明显的减弱，至注射后第24周时，已基本无诱导咬肌肌肉萎缩作用，推测这可能与A型肉毒毒素的化学去神经作用有关[12]。已有研究证实，在注射A型肉毒毒素12周后，骨骼肌在原先萎缩的肌肉中会建立起不同程度的功能连结，这种功能连结主要是以神经发芽的方式来实现的[13]。当萎缩的肌肉再次获得神经支配时，原先失去功能的神经末梢肌肉接头将重新恢复神经冲动的传递，肌肉将不再萎缩。因此，本次研究过程中所得出的推测是成立的。

咬肌是骨骼肌的一种，咬肌肌纤维根据参与生物氧化代谢所需酶的不同主要分为快肌、慢肌纤维两种类型[14]。本研究证实了A型肉毒毒素注射后能诱导人咬肌萎缩，但未研究A型肉毒毒素注射后引起何种类型的肌纤维发生萎缩。我们将进一步重点研究人咬肌在注射A型肉毒毒素后何种类型肌纤维发生组织形态学改变，旨在为良性咬肌肥大等骨骼肌肥大的A型肉毒毒素治疗提供科学指导。

综上所述，本研究观察了人咬肌内注射A型肉毒毒素后其组织形态学的改变，证实了A型肉毒毒素诱导咬肌萎缩的最佳作用时间为注射后3个月，最长有效时间可持续至注射后6个月，为临床上使用A型肉毒毒素治疗良性咬肌肥大等骨骼肌肥大提供了重要的依据。

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本文引用格式：朱顺文,王君,马昊,等.人咬肌内注射A型肉毒毒素后组织形态学观察[J].中国美容整形外科杂志,2017,28(3):141-144. DOI:10.3969/j.issn.1673-7040.2017.03.006.

关于图的要求

图包括曲线图、示意图、照片等。每一图应有简短确切的题名，连同图号置于图下。必要时，应将图上的符号、标记、代码，以及实验条件等，用简练的文字，横排于图的下方，作为图例说明。

曲线图的纵横坐标必须标注“量、标准规定符号、单位”。此三者只有在不必要标明(如无量纲等)的情况下方可省略。坐标上标注的量的符号和缩略词必须与正文中一致。

照片图要求主题和主要显示部分的轮廓清晰，层次分明，反差适中，无杂乱背景。人体照片只需显示必要部位，但应能看出是人体的哪一部分。颜面或全身照片，若无须显示眼部和阴部，应说明需遮盖。使用特定染色方法的显微照片，应标明染色方法。显微照片中使用的符号、箭头或字母，应与背景有很好的对比度。涉及尺寸的照片上应该有表示目的物尺寸的标度。

Histomorphologic changes of masseter muscle after botulinum toxin A injection

ZHU Shun-wen,WANG Jun,MA Hao,XU Guo-dong,MA Fu-shun.(Weifang Medical University,Weifang 261042,China)

ObjectiveThe histomorphologic changes ofmasseter muscle after botulinum toxin A injection were observed.M ethodsFrom April 2011 toOctober 2015,60 patients with bilateral mandibular and masseter hypertrophy were involved in this study.There were a total of120 masseter muscle specimens.Among them,60 specimens without botulinum toxin A injection were selected as the control group,and the other 60 specimens,with botulinum toxin A injection,as the experimental group.Paraffin section and HE stainingwere performed in both two groups.Basic structure of the masseter muscle fiber was observed under light microscope and the cross-sectional area was measured.The data above were analyzed statistically.ResultsNo change of the basic structure of the masseter muscle fiber was found between the two groups.Compared to the control group,the cross-section area of the masseter muscle fiber decreased more significantly(P＜0.05).The cross-section area of the masseter muscle fiber reached a minimum at the 12th week and gradually recovered after that.No further changes were noticed after another 12-week interval.ConclusionMasseter muscle atrophied after Botulinum toxin A injection.The masseter muscle reached a minimum at the 12th week,and no obvious change occurred after that.

Botulinum toxin type A;Masseter muscle fibers;Masseteric hypertrophy;Cross-section area

MA Fu-shun,Email:fushunma@hotmail.com

2016-10-23）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.03.006

1.潍坊医学院，山东 潍坊 261042；2.潍坊市人民医院病理科，山东 潍坊 261042

马福顺，Email：fushunma@hotmail.com