神农镇痛膏中士的宁的控制方法及标准研究

甘曙光+胡吉迪+曹越

[摘要]目的 建立神农镇痛膏中士的宁的含量测定方法，并制定其限量标准。方法 采用C18色谱柱，流动相为A相（乙腈）∶B相（0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L KH2PO4等量混合溶液，用10% H3PO4调节pH值到2.8）=21∶79，流速为1.0 ml/min，柱温为30℃，检测波长为260 nm。结果 线性范围为54.048～2026.8 ng，r=0.9996，本方法的重复性和精密度良好（RSD<2.0%），其限量拟定为每100平方厘米含马钱子以士的宁（C21H22N2O2）计为0.20～1.00 mg。结论 本方法简便、准确、重复性好，可用于神农镇痛膏中士的宁的含量测定，其限量客观合理，保证了用药的安全有效。

[关键词]神农镇痛膏；士的宁；高效液相色谱法；含量测定

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）05（c）-0093-04

[Abstract]Objective To establish a content determination method of Strychnine in Shengnong Zhengtong Paste，and to set its limited quantity standard.Methods C18 chromatographic column was used， and the mobile phase was phase A （acetonitrile）∶phase B （0.01 mol/L heptane sodium sulfonate and 0.02 mol/L KH2PO4 of equal mixing solution，with 10% H3PO4 to adjust pH value to 2.8） =21∶79.The flow rate was 1.0 ml/min，the column temperature was 30 ℃，and the detection wavelength was 260 nm.Results The linear range was 54.048-2026.8 ng，r=0.9996，and the reproducibility and precision of this method was good （RSD<2.0%）.The limited quantity scheduled having maqianzi of 0.20-1.00 mg every 100 square centimeters calculating with Strychnine （C21H22N2O2）.Conclusion The method is simple，accurate and reproducible.It can be used for the determination of Strychnine in Shengnong Zhengtong Paste.Its limited quantity is objective and rational to ensure the safety of drug use.

[Key words]Shengnong Zhengtong Paste；Strychnine；High performance liquid chromatography；Content determination

神农镇痛膏的主要成分有三七、土鱉虫，这些具有活血化瘀，通经络之功效，乳香、川芎、红花、当归等成分对主药的功效起到加强作用；防风、马钱子、白芷具有祛风散寒的作用，冰片可以消肿止痛[1-2]。该产品能活性散瘀、消肿止痛[3-6]。马钱子为马钱科植物马钱（Strychnos nux-vomica L.）的干燥成熟种子，具有通络止痛，散结消肿的功效。用于风湿顽痹，麻木瘫痪，跌扑损伤，痈疽肿痛，小儿麻痹后遗症，类风湿性关节痛的治疗[7-8]。但其性味苦，有大毒[1]，须对其用量进行控制。马钱子主要成分为士的宁[9-12]，本文参考《中国药典》2010年版一部及相关文献[13-15]，以士的宁作为指标，建立检测方法，进行了可行性研究，根据结果建立士的宁的检测方法，通过样品与参照药对比研究，制定了控制范围，并进一步有效控制马钱子的用量，保证用药安全有效。

1 仪器与试药

安捷伦HP1100高效液相色谱仪；岛津SHIMADZU LC-20AT高效液相色谱仪；WelchromTM C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；KQ2200超声波仪（昆山市超声仪器有限公司）；士的宁（中检所提供，含量测定级，批号：110705-200306）；神农镇痛膏样品（黄石燕舞药业有限公司，规格为：9.5 cm×11.6 cm，20091101、20091102、20091103）；神农镇痛膏参照药（广东湛江吉民药业，规格：9.5 cm×11.6 cm，20081001、20081002）；甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 取神农镇痛膏样品1片，除去盖衬，对折，剪碎，置于锥形瓶中，加入二氯甲烷50 ml，加入浓氨试液1 ml，超声提取30 min（100 W，50 kHz），冷却至室温，倾出二氯甲烷液，用适量二氯甲烷洗涤锥形瓶。合并二氯甲烷液，用稀硫酸溶液萃取3次（60、60、50 ml），合并硫酸液，加浓氨试液调节pH至9～10，用二氯甲烷提取3次（60、60、50 ml），合并，回收二氯甲烷至干，残渣加甲醇复溶，置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释到刻度，混匀，过滤，即得。

2.1.2对照品溶液的制备

取士的宁对照品适量，精密称定，制成每毫升含40 μg/ml的甲醇溶液。

2.1.3 阴性对照溶液的制备

取阴性对照样品（无马钱子），照2.1制备，即得。

2.2 色谱条件的建立

2.2.1检测波长的选择

取士的宁对照品溶液进行扫描（λ：190～800 nm），结果在255 nm附近有最大吸收，参照《中国药典》2010年版一部，确定波长为260 nm。

2.2.2流动相的选择

参照《中国药典》2010年版一部及文献，流动相为A相（乙腈）∶B相（0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L KH2PO4等量混合溶液，用10%H3PO4调节pH值到2.8）=21∶79，结果显示主成分峰与其他峰能完全分离，保留时间恰当。

2.3 方法学研究

2.3.1 专属性试验

分别取2.1.1供试品溶液、2.1.2对照品溶液、2.1.3项阴性对照溶液，各进样10 μl，记录色谱图，结果表明士的宁的保留时间为17.8 min左右，保留时间适中，即可以有效分离主成分，又能兼顾工作效率。阴性样品（缺马钱子）在此位置没有色谱峰，样品中杂质与主成分峰分离良好。同时用DAD检测器分别对样品和对照品中的主成分峰进行峰纯度检查，峰纯度的match值为999.81，表明峰纯度很好，即色谱峰中只含有1种组分（图1～5）。

2.3.2 线性关系考察

配制浓度为5.4048、10.87、21.6192、48.6432、90.08、135.12、202.68 μg/ml的士的宁对照品溶液，进样10 μl，以峰面积A对进样量进行线性回归。结果表明，士的宁的进样量在54.048～2026.8 ng范围内时，Y=2.0156X+29.032（Y=峰面积，X=进样量，r=0.9996），该项结果表明，采用该色谱条件，检测的灵敏度较高，线性范围较宽，且线性关系良好。

2.3.3 重复性试验

取神农镇痛膏样品6份，按照上述方法进行检测，测定含量=0.51±0.00（n=6），RSD为0.16%。结果表明该方法具有较好的重复性。

2.3.4 准确度试验

采用加样回收的方法进行考查，取已知含量的样品（含量0.51mg/片）6份，分别加入浓度为198.66 μg/ml士的宁对照品溶液2 ml，按照上述方法检测，根据加入的量和测得的量计算回收率，平均回收率为98.5%，RSD为0.4%。结果表明，本法回收率良好，专确度较高。

2.3.5 耐用性试验

2.3.5.1色谱柱的影响 考察了2种商品规格的色谱柱，取同一供试品溶液及对照品溶液进行检测。含量测定结果一致（表1），2种商品规格的色谱柱均能达到较好的分离度。

2.3.5.2仪器的影响 选用2种不同的高效液相色谱仪，取同一供试品溶液及对照品溶液进行检测。含量测定结果一致（表2），采用2种不同的仪器均能达到较好的分离度。

2.3.5.3样品溶液的稳定性考察 取神农镇痛膏样品，按照上述方法操作，在不同的时间点进样检测，峰面积=984.76±0.39（n=6），RSD为0.04%，结果表明，供试品在12 h内稳定，能够满足样品检测的需要。

该项结果显示，在使用不同的色谱柱，或者使用不同的仪器进行检测，测得的结果基本一致，且供试品溶液稳定性较好，表明该方法具有较好的耐用性。

2.4 含量限度的制定

采用以上检测方法，对11批次的神农镇痛膏样品及参照药分别测定含量，结果见表3。

综合样品含量测定的结果，考虑厂家实际生产情况，含量限度按以上11批样品的含量分布情况拟定，根据神农镇痛膏的规格9.5 cm×11.6 cm与新增加的规格7 cm×10 cm两者面积大小的不同，按膏药片的面积计算，神农镇痛膏中马钱子中士的宁的限量检测暂拟订为：本品每100平方厘米含马钱子以士的宁（C21H22N2O2）计算为0.20～1.00 mg。

3 讨论

马钱子药用历史悠久，具有兴奋中枢神经、镇痛抗炎、抗血栓、强心、改善血液微循环等药理作用。其味苦，性温，有大毒。马钱子主要含生物碱类、苷类、酸类、醇类等化学成分[9-10]，其中含生物碱1.5%～5%，生物碱类主要成分为士的宁，其主要成分既是有效成分也是毒性成分。故以士的宁为检测指标[7]。

采用本文所建立的方法，峰形对称且稳定，和相邻杂质峰分离较好，空白溶剂和空白辅料对本法无干扰，选用不同色谱柱和不同仪器测定，含量测定结果一致，均能达到试验要求，表明系统适用性较好。本法简便、准确、重现性好，样品溶液稳定，可作为神农镇痛膏中士的宁含量测定方法。所确定的控制标准在保证用药安全有效的前提下，参考了相同品种的水平，也兼顾到了生产实际，是确实可行的。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.卫生部药品标准：中药成方制剂：第十册[M].北京：人民卫生出版社，1995：130.

[2]国家药典委员会.中国药典[M].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：50-51.

[3]林振洪，王其新.神农镇痛膏的薄层色谱鉴别[J].中药材，1998，21（7）：373-374.

[4]吴洪，韦哲，郭胜.神农镇痛膏治疗急性软组织损伤88例疗效观察[J].新中医，2007，39（9）：57-58.

[5]梁晓东，陈涛，曹永仓，等.马钱子配伍白术前后对大鼠佐剂关节炎的影响[J].中华中医药杂志，2016，31（1）：235-238.

[6]李哲，熊维政，李磊，等.正交试验法优选神农镇痛膏醇提工艺[J].中医学报，2015，30（11）：1647-1649.

[7]刘学敏，王晓明，赵金玲，等.马钱子的化学成分和药理作用研究[J].内蒙古中医药，2013，32（14）：52-53.

[8]吴小娟，马凤森，郑高利.马钱子吲哚类生物碱毒性研究进展[J].中药药理与临床，2016，32（6）：231-235.

[9]刘锡葵，李薇.马钱子果化学成分研究[J].中草药，1998，29（7）：435-438.

[10]解宝仙，唐文照，王利红，等.马钱子化学成分研究[J].中药材，2016，39（1）：86-89.

[11]王丹丹，李俊松，蔡宝昌.HPLC法同时测定制马钱子中4种生物碱类成分的含量[J].药学与临床研究，2008，16（6）：523-524.

[12]张加余，张倩，張凡，等.HPLC-ESI-MS-MS鉴定马钱子中4类生物碱成分[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（9）：147-151.

[13]吴小娟，马凤森，喻炎.马钱子碱和士的宁的硅胶柱色谱与半制备高效液相色谱法联用分离纯化[J].时珍国医国药，2016，27（9）：2145-2147.

[14]王雪，金朗，王炳强.HPLC法测定接骨丸中马钱子士的宁含量[J].河南中医，2016，36（6）：1102-1104.

[15]娄玉霞.反相高效液相色谱法测定桂枝马钱片中士的宁和马钱子碱的含量[J].风湿病与关节炎，2016，5（12）：42-44，69.

（收稿日期：2017-04-01 本文编辑：许俊琴）