不同温度条件下养殖大菱鲆菌群变化和货架期预测

郭全友，包海蓉，何 木，朱彦祺

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306；3.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093）

不同温度条件下养殖大菱鲆菌群变化和货架期预测

郭全友1，包海蓉2，何 木3，朱彦祺3

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306；3.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093）

对低温（0～10 ℃）、室温（25 ℃）和变温贮藏条件下养殖大菱鲆的细菌种群变化进行研究，确定不同温度条件下养殖大菱鲆的优势腐败菌和货架期，并采用Exponential、School-field和Square-root方程构建货架期预测模型，并对货架期预测模型的适用性进行评价和验证。结果显示，低温贮藏大菱鲆货架期为6.1～32.6 d，优势腐败菌为腐败希瓦氏菌（40.3%）和假单胞菌属（27.4%），室温时货架期为1.3 d，优势腐败菌为气单胞菌（47.1%）和腐败希瓦氏菌（29.4%）；构建的Exponential、School-field和Square-root货架期模型参数分别为温度特征系数a=0.12，Tmin=－6.6 ℃，表观活化能（Ea）为81.4 kJ/mol，采用均方根误差、残差平方和、偏差度、准确度对模型的拟合优度进行比较，Square-root模型预测性能最优，用恒温和变温对3 种货架期预测模型进行验证，显示Square-root货架期模型误差最小，可有效预测恒温和变温条件下大菱鲆的货架期。

养殖大菱鲆；细菌菌群；优势腐败菌；货架期预测

引文格式：

郭全友, 包海蓉, 何木, 等. 不同温度条件下养殖大菱鲆菌群变化和货架期预测[J]. 食品科学, 2017, 38(11): 231-236. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711037. http://www.spkx.net.cn

GUO Quanyou, BAO Hairong, HE Mu, et al. Shelf life prediction and spoilage bacteria changes of farmed turbot (Scophthalmus maximus) at different storage temperatures[J]. Food Science, 2017, 38(11): 231-236. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711037. http://www.spkx.net.cn

大菱鲆（Scophthalmus maximus）属鲽形目鲆科鱼类，1992年引自英国，在国内外具有广泛的市场，2012年产量约11.36万t，是一种重要的养殖经济鱼类，被誉为“一鲆二镜三鳎”之首[1]。大菱鲆以鲜活流通为主，也包括咸干、烤制和熏制等产品形式。为了避免其运输过程中的腐败变质，冰鲜冷链流通逐渐成为其运输的主要方式。这是因为从大菱鲆的捕获、处理、加工到消费终端，鱼体温度较高会加速酶解和细菌腐败的速率，而低温贮藏能够有效地降低其鲜度损失。冰鲜冷链流通通常以加冰运输的形式，以保证鱼体温度不大于2 ℃，在此过程中辅以快冷致死、离子照射及添加保鲜剂等可有效延长其货架期（shelf life，SL）[2-3]。但低温贮藏的代价相对昂贵，最高安全限值常设为8 ℃[4]。在实际冷链流通过程中，鱼体常常脱离冷链，贮藏温度并不固定，因此，建立不同温度条件下货架期预测模型对实时监控鲜度状况及采取有效措施具有重要意义。

研究者对养殖大菱鲆品质、腐败菌群、货架期、冷却保鲜等进行了一定研究[5-6]。依据冷藏大菱鲆的特定腐败菌构建的货架期预测模型，可快速准确预测大菱鲆0～10 ℃贮藏过程中的鲜度变化和剩余货架期[6]，若超出低温范围，导致鲜鱼腐败的细菌种群存在较大差异，货架期预测模型亦无法做出预测。因此，本实验通过对鲜活、低温、常温和变温贮藏过程中的大菱鲆感官、理化和微生物学鲜度指标及细菌菌群的研究，确定低温和室温（25 ℃）条件下货架期和优势腐败菌，采用经验模型构建货架期预测模型，用恒定和波动温度条件下货架期进行验证，为有效克服微生物检测的滞后性和温度范围限制，实现养殖大菱鲆恒定和波动温度条件下货架期的快速预测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品处理

本实验中所用鲜活大菱鲆购自上海市铜川路水产批发市场，加氧袋装至实验室，冰水致死，分别进行低温（0、3、7 ℃和10 ℃）、室温（25 ℃）和变温（0 ℃→5 ℃→15 ℃→25 ℃→8 ℃）贮藏，用温度-时间记录仪记录温度变化，1 次/h，合适间隔取样。

1.2 仪器与设备

IUL自动菌落计数仪 西班牙CounterMat Flash公司；MIR253培养箱 日本三洋公司；MIDI微生物鉴定系统美国Microbia公司；微生物鉴定系统 美国Biolog公司；175-T2时间温度记录仪 德国Test公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪、3730测序分析仪 美国Allied Business Intelligence公司；CFC培养基英国Oxoid公司；胰酶解大豆胨琼脂 美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 指标测定

1.3.1.1 挥发性盐基氮值的测定

挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值的测定参照SC/T 3032—2007《水产品中挥发性盐基氮的测定》。

1.3.1.2 三甲胺值的测定

三甲胺（trimethylamine，TMA）值的测定参照李学英等[7]的方法。

1.3.1.3 微生物计数

菌落总数（total viable counts，TVC）：参照GB 4789.2—2010《食品微生物学检验 菌落总数测定》，取3 个合适梯度的稀释液，涂布于琼胶培养基上，25 ℃培养48 h，计数；产H2S菌数：用铁琼脂IA双层平板上，25 ℃培养72 h，计数黑色菌落；假单胞菌数：涂布于CFC培养基上，25 ℃培养48 h。

1.3.1.4 细菌鉴别

选取菌数合适（30～100 CFU/g）且分散均匀的平板，依据菌落形态、革兰氏染色、芽孢有无和生理生化等特征，参照Brown推荐的微生物鉴定图谱和《伯杰氏细菌鉴定手册》等，运用双歧分类法进行多相分类，采用Sherlock MIS系统对不同组别菌株进行鉴定。若同组出现相异结果，用Biolog GEN-Ⅲ板和16S rRNA测序进行确认。

1.3.2 大菱鲆货架期预测模型构建、评价和验证

1.3.2.1 货架期模型构建

综合TVB-N值、TMA值和TVC等指标确定货架期终点；温度对货架期（SL）的影响用腐败速率（rate of spoilage，RS），即货架期的倒数（day－1）表示。温度为T时的腐败速率除以参考温度Tref时的腐败速率，即相对腐败速率（relative rate of spoilage，RRS），为参考温度条件下货架期与实际温度条件下货架期的比值。拟合模型包括RRS的Exponential模型、School-field模型、Squareroot模型，分别见式（1）～（3）[3,8]。

式中：T为贮藏温度/℃；R为气体常数，8.314 J/（mol·K）；Ea为表观活化能/（kJ/mol）；a为温度特性系数；Tmin为理论最小温度/℃；Tref为参考温度/℃。

1.3.2.2 货架期模型评价与验证

模型评价：采用R2、准确度（Af）、偏差度（Bf）、残差平方和（residual sum of squares，RSS）和均方根误差（root mean square error，RMSE）等对模型拟合优度进行评价，R2、Af和Bf值越接近于1，RMSE越接近于0，预测效果越好[3,8-9]。方程如下，其中Xcal和Xobs分别为预测值和实测值。模型验证：用3 ℃和变温时的货架期对恒温和变温货架期预测模型进行验证。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0软件中One-way ANOVA和双尾检验进行差异及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 大菱鲆鲜度品质和货架期

由表1可知，大菱鲆冷藏初始TVB-N值和TMA值分别为（7.60±2.73）mg/100 g和（0.04±0.04）mg/100 g，符合鲜海水鱼一级要求。大菱鲆初始菌数主要与养殖环境、季节及预处理等相关，其TVC、产H2S菌和假单胞菌数分别为（3.67±0.17）、（2.58±0.58） （lg（CFU/g））和（3.06±0.58）（lg（CFU/g）），在低温条件下延滞期较长，室温条件下延滞期极短，能够迅速进入生长期。由于酶和腐败菌的作用，其蛋白质分解产生氨和胺类等碱性含氮物质。这一类含氮物质，即TVB-N，具有较强的挥发性，严重影响大菱鲆的感官品质；其含量越高，说明腐败的程度越大。此外，在腐败过程中，氧化TMA（氧化态）会被还原为TMA（还原态）。因此，TVB-N和TMA值常作为海水鱼腐败的化学指标。

表1 不同温度贮藏条件下养殖大菱鲆各指标的变化（n=3）Table 1 Change in biochemical parameters of farmed Scophthalmus maximus stored at different temperatures (n= 3)

大菱鲆低温（10 ℃）贮藏货架期终点TVC、产H2S菌数和假单胞菌数分别为（7.46±0.53）、（6.80±0.17） （lg（CFU/g））和（7.26±0.34）（lg（CFU/g）），TVB-N和TMA平均值分别为（34.38±0.65）mg/100 g和（11.06±0.41）mg/100 g，室温贮藏大菱鲆货架期终点时TVC、产H2S菌数和假单胞菌数为（7.06±0.06）、（6.89±0.09）（lg（CFU/g））和（7.03±0.10）（lg（CFU/g）），略高于低温的货架期终点值，且假单胞菌数高于产H2S菌数。TVB-N和TMA值分别为（35.05±0.12）mg/100 g和（9.11±0.09）mg/100 g。变温贮藏大菱鲆货架期终点时TVC、产H2S菌数和假单胞菌数分别为（6.97±0.65）、（5.75±0.21）（lg（CFU/g））和（6.35±0.10）（lg（CFU/g）），TVB-N和TMA值分别为（29.68±1.58）mg/100 g和（8.86±0.08）mg/100 g。大菱鲆货架期终点时TVB-N值约为（29.12～35.05）mg/100 g，基本处在TVB-N值处在低温贮藏鱼可接受界限范围（30～35 mg/100 g），TVC基本处在ICMS推荐的细菌限量值107CFU/g范围内[10-12]。综合大菱鲆感官、化学和微生物等指标，确定低温（0～10 ℃）和室温的货架期为6.1～32.6 d和1.3 d，4 ℃冷藏货架期为12 d在所得范围之内[5]。

2.2 大菱鲆贮藏过程细菌菌相变化

表2和表3为大菱鲆初始和货架期终点细菌相。检出的14 种菌中革兰氏阴性均占优势，约占75%～90%；革兰氏阳性菌占5.0%～17.3%，主要包括假单胞菌、肠杆菌和腐败希瓦氏菌，弧菌属（Vibrio spp.）也是常见水生菌和鱼类典型菌，综合比例平均值比例达到17.9%。a

表2 大菱鲆初始细菌菌相组成Table 2 Initial bacterial flora composition of Scophthalmus maximus

表3 低温和室温贮藏大菱鲆货架期终点菌相组成Table 3 Bacterial flora of farmed Scophthalmus maximus stored aerobically at low or ambient temperatures at the end of shelf life

低温贮藏过程细菌相发生了较大变化，货架期终点时细菌菌相包括腐败希瓦氏菌（40.3%）、假单胞菌属（27.4%）和不动杆菌（14.9%），并出现了少量的嗜麦芽窄食单胞菌和气单胞菌等。分离的腐败希瓦氏菌能产生H2S，还原氧化三甲胺产生TMA，对过氧化氢酶和氧化酶阳性，是一种非发酵、运动性的革兰氏阴性杆菌，与低温冷藏海水鱼类的主要腐败细菌为希瓦氏菌一致[3,13]，与0 ℃贮藏三文鱼特定腐败菌为荧光假单胞菌存在一定差异[14]。室温（25 ℃）贮藏大菱鲆优势腐败菌为气单胞菌（47.1%），并出现了一定比例的腐败希瓦氏菌（29.4%）。低温与室温的菌相差异明显，说明温度和环境是影响细菌生长繁殖的关键因素。

2.3 大菱鲆RRS模型构建与评价

以0℃为参考温度，0、7、10 ℃和25 ℃的RRS值分别为1.00、4.05、5.36和25.07，采用Exponential、School-field和Square-root方程对RRS值和温度相关性进行拟合，得到RRS值模型（表4），可知温度特征系数=0.12，Tmin=－6.6 ℃，表观活化能（Ea）为81.4 kJ/mol。

采用Bf、Af、RSS和RMSE对3 种相对腐败菌速率模型的拟合优度进行评价[16]。Bf=1.0表示预测值与实测值间没有误差，偏差1.1和0.9分别表示预测值的上下偏差各为10%，0.75～1.25被认为是可靠的[8,15]。3 种模型的Bf为0.90～1.03（表5），表明3 种模型预测值是可靠的。

表4 大菱鲆3 种相对腐败速率模型构建Table 4 Establishment of three predictive models for relative spoilage rate of farmed Scophthalmus maximus

表5 大菱鲆3 种RRS模型的预测性能评价Table 5 Evaluation of predictive performance of three RRS models for farmed Scophthalmus maximus

Af为1.0时表示实测值与预测值相同，Af＞1表示实测值与预测值之间存在差异性，1.1的准确度说明预计值和实际值之间的平均差异是10%[17-18]，Af＜1.30表示模型是可接受的，当Af＞1.3被认为实测值和预测值具有较大偏差。Bf中Square-root的值最低，表示其准确度相对更高，同时RSS与RMSE也均明显小于其余的2 种模型。综合Bf、Af、RSS和RMSE等评价参数，大菱鲆的Square-root模型评价参数值均最低，表明其预测性能最优。

2.4 大菱鲆恒温货架期预测模型构建与验证

常选取0 ℃作为新鲜鱼类货架期模型的参考温度，把0 ℃大菱鲆货架期（32.6 d）和温度特性系数a、Ea及Tmin代入式（1）～（3），得到恒定温度条件下的货架期预测模型（式（8）～（10））。利用式（8）～（10）可计算出大菱鲆3 ℃贮藏时货架期预测值，分别为22.7、22.1 d和15.6 d（表6），货架期实测值与预测值之间的相对误差为44.6%、40.8%和－0.6%，表明式（10）能较好预测恒温条件下大菱鲆的货架期。

表6 恒温和变温有氧贮藏大菱鲆货架期预测模型验证Table 6 Validation of shelf life predictive models for chilled cultured fish stored aerobically under isothermal and non-isothermal conditions

2.5 大菱鲆变温货架期预测模型构建与验证

采用式（8）和式（10），把不同温度条件下的所经历的贮藏时间（storage time，ST）转化为参考温度条件下的贮藏时间[19-20]，转化值与参考温度条件下的货架期差值，即以推导一定温度条件下的剩余货架期预测方程（式（11）～（13））[21-22]。

式中：RSLT为温度T时的剩余货架期/d；STTn为温度Tn时的贮藏时间/d。

由表6可见，大菱鲆经波动温度后，到达货架期终点（8.6 d），得到波动温度情况下货架期的预测值分别为12.4、10.7 d和7.5 d，相对误差分别为44.2%、24.4%和7.5%。通过比较3 种剩余货架期预测模型的相对误差，可知平方根剩余货架期模型能很好地预测大菱鲆剩余货架期。郭全友等[23]开发的大黄鱼School-field及Exponential货架期模型性能优于Square-root货架期模型，能快速有效预测0～25 ℃范围的大黄鱼品质；潘文龙等[24]证明了零级化学反应动力学更适合指示河鲫鱼各指标品质变化规律；吴奇子等[25]构建了鲐鱼货架期预测模型，证明一级化学反应动力学模型更加适合，表明每种水产品预测模型的适用性具有差异性[26-30]。

3 结 论

大菱鲆初始细菌种群较复杂，共分离出14 种细菌；低温贮藏优势腐败菌为腐败希瓦氏菌，室温优势腐败菌为气单胞菌。低温贮藏大菱鲆货架期为6.1～32.6 d，室温时货架期为1.3 d；整个货架期内，大菱鲆的TVB-N、TMA值和TVC之间呈显著相关（P＜0.01），终点时分别为29.12～35.05、8.86～11.30 mg/100 g和107CFU/g。采用了3 种模型，Exponential、School-field和Squareroot对相对腐败速率进行拟合，并采用R2、Af、Bf、RSS和RMSE等对拟合优度进行评价，结果显示大菱鲆的Square-root模型预测性能和拟合度最好。构建了恒温和变温条件下货架期和剩余货架期预测模型，验证结果显示Square-root模型能很好预测大菱鲆货架期和剩余货架期。

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Shelf Life Prediction and Spoilage Bacteria Changes of Farmed Turbot (Scophthalmus maximus) at Different Storage Temperatures

GUO Quanyou1, BAO Hairong2, HE Mu3, ZHU Yanqi3
(1. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China; 2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

Changes in physicochemical indicators and bacterial flora of farmed Scophthalmus maximus stored at low (0–10 ℃), ambient and fluctuating temperatures were determined. Meanwhile, the predominant spoilage organisms and shelf life under the three storage conditions were also studied, and shelf-life predictive models were fitted by means of Exponential, School-field and Square-root equations, respectively and their goodness of fit was evaluated. The results showed that the shelf life of farmed Scophthalmus maximus was 6.1–32.6 days at low temperature, and the predominant spoilage bacteria were Shewanella putrefaciens (40.3%) and Pseudomonas spp. (27.4%); the shelf life was 1.3 days at room temperature, and the predominant spoilage bacteria were Aeromonas spp. (47.1%) and Shewanella putrefaciens (29.4%). The temperature characteristic coefficient a, theoretical minimum temperature Tminand activation energy Eafrom the Exponential, Schoolfield and Square-root models were 0.12, –6.6 ℃ and 81.4 kJ/mol, respectively. The goodness of fit of the three models was compared by accuracy factor (Af), bias factor (Bf), root mean square error (RMSE) and mean residual error (MRE), and the predictive ability of the Square-root model was better than that of other models. The model predictions were experimentally validated under isothermal and non-isothermal conditions, and the relative error of the Square-root model was lower than that of the other models, suggesting that it could be used as a reliable to accurately predict the shelf life of farmed Scophthalmus maximus under isothermal and non-isothermal conditions.

farmed Scophthalmus maximus; bacterial flora; predominant spoilage bacteria; shelf life prediction

10.7506/spkx1002-6630-201711037

S983

A

1002-6630（2017）11-0231-06

2016-07-21

国家自然科学基金面上项目（31371867）；上海市自然科学基金项目（16ZR1444900）；中国水产科学研究院东海水产研究所基本科研业务费专项（2011M04；2014G02）

郭全友（1974—），男，副研究员，博士，研究方向为水产品加工与安全保障。E-mail：dhsguoqy@163.com