二氢睾酮联合ADSC对大鼠脊髓损伤BDNF及其受体TrkB的影响

王 莹 李文媛(通讯作者) 尹国华 李智刚 金在顺 滕诚毅 孙 平

1)牡丹江医学院解剖教研室 牡丹江 157011 2)牡丹江医学院第二附属医院 牡丹江 157011 3)牡丹江医学院病理教研室 牡丹江 157011

二氢睾酮联合ADSC对大鼠脊髓损伤BDNF及其受体TrkB的影响

王 莹1)李文媛1)(通讯作者) 尹国华2)李智刚1)金在顺3)滕诚毅1)孙 平1)

1)牡丹江医学院解剖教研室 牡丹江 157011 2)牡丹江医学院第二附属医院 牡丹江 157011 3)牡丹江医学院病理教研室 牡丹江 157011

目的 探讨二氢睾酮(DHT)与脂肪源性干细胞(ADSC)联合应用对大鼠脊髓损伤后脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体酪氨酸激酶B(TrkB)的表达和功能恢复的影响。方法 30只成年SD大鼠制备脊髓挫伤模型，随机分为对照组、ADSC组和DHT+ADSC组。BBB行为学和电生理方法检测运动功能的恢复，Western bolt检测脊髓损伤灶BDNF及其受体TrkB的蛋白表达。HE染色观察脊髓损伤灶面积，免疫荧光示踪PKH26标记的移植ADSC。结果 与ADSC组比较，DHT+ADSC组脊髓损伤灶内BDNF和TrkB蛋白相对表达明显增高，PKH-26标记的ADSC数量显著增高(P<0.05)。与对照组比较，ADSC组和DHT+ADSC组电生理波幅增高、神经传导速度增快、延迟期缩短，其中DHT+ADSC组神经功能恢复作用显著优于ADSC组(P<0.05)，且DHT+ADSC组BBB指数高于对照组和ADSC组。结论 二氢睾酮联合ADSC移植对大鼠脊髓损伤后改善损伤灶和功能恢复的作用优于ADSC组，其机制可能与二氢睾酮促进损伤灶BDNF及其受体TrkB表达，进而促进移植的ADSC存活有关。

二氢睾酮；脂肪源性干细胞；脊髓损伤；脑源性神经营养因子；酪氨酸激酶B

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是由于各种因素引起脊髓病变导致机体感觉、运动、肌力异常等一系列病理变化过程。脊髓损伤影响全球数百万人，常对患者造成巨大的伤害[1]。近年来发现，性腺类固醇激素睾酮为中枢神经系统损伤后许多病理生理改变提供广泛的神经保护和治疗作用[2]。睾酮可通过抑制氧化应激反应进行神经保护和防止神经元细胞死亡，降低炎症和自由基表达，并能够加速失神经轴突再生和功能恢复[3]。研究表明，睾酮还能够显著促进神经营养因子脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor，BDNF)等表达[4]，但其在脊髓损伤的作用及其机制报道较少。

我们前期研究[5]已证实，脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cell，ADSC)作为种子细胞能够有效促进脊髓损伤神经修复，但单独使用ADSC运动功能恢复效果并不理想。本研究拟将ADSC联合在体内具有较强睾酮活性的雄激素二氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)治疗，探讨二氢睾酮联合ADSC对脊髓损伤后BDNF信号通路和功能恢复的影响，为脊髓损伤提供新的治疗方法。

1 材料和方法

1．1 细胞培养 参照前期研究方法取小鼠腹部脂肪组织进行ADSC细胞分离、培养及传代[4]，2周后茜草素红染色鉴定ADSC向成骨诱导的细胞，经细胞鉴定后取第4代ADSC行PKH26(Sigma公司，美国)染色标记[6]，进行体内移植实验。

1．2 动物模型制备 30只成年Sprague Dawley(S-D)大鼠，雌雄各半，体质量(200±20)g，购于哈尔滨医科大学实验动物中心[许可证号：SCXK(黑)203-001]。手术前给予大鼠充分食物和水。用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，术区备皮，常规消毒、铺无菌单，以肋骨为定位中心，大鼠背部棘突体表作一长约3 cm手术切口，切开皮肤、皮下组织，剥离椎旁肌肉，止血，显露棘突、椎板及关节突。用咬骨钳咬除T10及部分T9、T11椎板，显露脊髓。在显微镜下可见一正中静脉，用显微外科剪垂直剪短右侧脊髓，术中见大鼠双下肢出现抽动，瘫痪，镜下可脊髓右半部分完全横断，表现造模成功[2]。

1．3 动物分组 30只大鼠按体质量随机分为：(1)对照组(n=10)：脊髓半离断损伤，注入100 μL PBS于损伤灶；(2)ADSC组(n=10)：注入等剂量ADSC(1×106个/100 μL)于脊髓损伤灶；(3)DHT+ADSC组(n=10)：同ADSC组方法进行后，皮下给予DHT 0.2 mL(含有DHT 0.8 mg密度为4.0 mg/mL的医用玉米油溶液，Sigma公司，美国)注射[7]，1次/d，给药1周。3组术后28 d麻醉取材。

1．4 HE染色 冰冻切片在空气中干燥1～2 d，用蒸馏水浸泡1～2 min；苏木素溶液中浸泡1 min，蒸馏水洗净。用1%盐酸处理30 s，蒸馏水冲洗3 min，80%酒精脱水1～2 min，在伊红染色1～2 min，蒸馏水洗净，80%乙醇1 min、95%乙醇1 min、无水乙醇1 min、二甲苯 1 min，二甲苯1 min、二甲苯1 min，擦干后中性树胶的封片。显微镜下观察。

1．5 Western Bolt 检测 Western Bolt检测采用BCA定量试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白后转至硝酸纤维素膜；封闭缓冲液封闭后，加入兔抗BDNF抗体(1：200，Sigma公司，美国)和兔抗TrkB抗体(1：200，Sigma公司，美国)，4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的抗小鼠的二抗(1：2 000)孵育 2 h，TBS洗净后经显色液显示15 min，扫描后经 Image J 图像分析软件对印迹区进行灰度分析。

1．6 BBB检测 术后在不同时间点进行行为学评分，根据BBB评分系统[7]观察后肢运动功能的恢复情况，为确保评分的准确性，均由2个人对大鼠2个后肢进行了评价，取平均分，评分时间均在每天20：00。

1．7 电生理检测 采用经颅磁刺激MEP方法进行电生理检测[4]，应用诱发电位仪和磁刺激器(Magstim 公司，英国)经颅磁刺激运动诱发电位观察神经传导潜伏期、传导速度及波幅改变，将电磁线圈置于颅骨激活皮层下组织诱发电生理反应，每只鼠检测4次取平均值。

2 结果

2．1 ADSC培养与分化 原代培养ADSC 8 d后形成的细胞群落较为密集，ADSC呈多角形或梭形伸展，有铺路石状特征。ADSC分化诱导成骨28 d后，可见分化细胞内的钙沉积茜素红染色(图1)。

图1 A：原代培养ADSC 8 d后呈铺路石状 B：ADSC分化诱导成骨，细胞内的钙沉积茜素红染色

2．2 HE染色结果 HE染色可见脊髓T10节段损伤灶，与对照组比较，DHT+ADSC组和ADSC组脊髓损伤灶面积比显著降低，其中DHT+ADSC组损伤灶面积比低于ADSC组(F2，12=43.79，P<0.001)。见图2。

图2 各组脊髓T10损伤灶HE染色 AAV2-KLF7组与AAV2组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=5，标尺：500 μm

2．3 Western Bolt结果 DHT+ADSC组和ADSC组脊髓损伤灶中BDNF及其受体TrkB蛋白表达较对照组显著增高，其中联合组BDNF及其受体TrkB蛋白表达高于ADSC对照组(BDNF：F2，12=49.28，P<0.001；TrkB：F2，12=61.43，P<0.001)。见图3。

图3 Western Bolt实验检测各组脊髓损伤灶中BDNF和TrkB 蛋白相对表达，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=5

2．4 免疫荧光染色观察 荧光显微镜下可见DHT+ADSC组和ADSC组在脊髓损伤灶有PKH26标记的ADSC，DHT+ADSC组PKH26阳性表达显著高于ADSC组(t=7.24，df=10，P<0.01。见图4。

图4 术后4周ADSC组和KLF7+ADSC组损伤灶PKH26免疫荧光观察(A)、PKH26光密度值(B)，**P<0.01，n=5，标尺：100 μm

2．5 BBB检测 术后28 d，与对照组比较，DHT+ADSC组和ADSC组BBB指数显著增高(F2，27=29.37，P<0.001)，而DHT+ADSC组与ADSC组差异并不显著(P>0.05)。见图5。

图5 BBB评分 *P<0.05，n=5

2．6 神经电生理检测 与对照组比较，ADSC组和DHT+ADSC组神经传导速度及波幅显著增加，而延迟期缩短，其中联合组改善神经电生理参数优于ADSC组(神经传导速度：F2，15=65.22，P<0.05；延迟期：F2，15=14.32，P<0.05；波幅：F2，15=19.65，P<0.05。见表1。

表1 各组神经电生理参数检测±s，n=5)

注：与对照组比较，*P<0.05；与ADSC组比较，#P<0.05

3 讨论

脊髓损伤除了会导致机体感觉和随意运动的障碍和影响自主神经系统，同时导致多个器官功能障碍或衰竭，常对患者造成巨大伤害。为此，脊髓损伤成为全世界的研究热点，其机制仍然不是很明确[1-2]。

我们前期研究发现[5，8]，种子细胞ADSC可合成和分泌大量神经营养因子，如神经生长因子、血管内皮生长因子等，这些促进神经生长的因子表达变化提供轴突生长的营养。本研究电生理检测结果也再次证实ADSC能够促进脊髓损伤后功能恢复，但BBB指数结果表明ADSC组神经功能恢复效果并不尽如人意，尽管其BBB指数有增高趋势，大量研究证实[5-9]，联合治疗能够克服多种抑制神经轴突再生的因素，较单一治疗效果更为明显。

研究证实睾酮具有神经保护作用，在中枢神经系统中，睾酮能够促进体外培养的海马神经元细胞存活，防止皮质锥体细胞损伤诱导的树突萎缩[2]，促进脑卒中后早期功能恢复，并刺激周围神经损伤后运动神经元轴突的生长[10]。而在周围神经系统中，睾酮能够加速面神经、舌下神经、坐骨神经轴突再生和神经切断后功能恢复[11-12]，但其促进轴突再生的机制尚不明确。本研究结果证实，术后4周与ADSC组比较，联合组BDNF及其受体TrkB蛋白在脊髓损伤灶内表达显著增高，证实二氢睾酮治疗能够有效激活BDNF细胞信号，与以往研究结果一致[3]，其机制可能是BDNF的表达是通过钙依赖的信号通路进行调节，而cAMP反应元件(CRE)和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)参与其信号通路发挥调节作用。睾酮已证实能够有效激活CRE和CREB，因此，睾酮介导cAMP信号通路能够调控和促进BDNF产生[11]。

另外，本研究还发现联合组损伤灶PKH26标记阳性细胞个数显著高于ADSC组，且损伤灶面积比也显著低于于ADSC组，因此，我们推测二氢睾酮可能通过激活BDNF细胞信号，促进移植的ADSC增殖和存活，进而改善脊髓损伤灶。研究还发现，与对照组相比，ADSC组和DHT+ADSC组显著改善电生理参数，说明ADSC组和联合组均能够促进脊髓损伤后功能恢复，但二氢睾酮联合ADSC治疗效果明显优于ADSC组，其BBB指数也高于对照组和ADSC组，证实二氢睾酮联合ADSC能够协同促进神经功能恢复。

综上所述，本研究探讨联合应用二氢睾酮和ADSC治疗脊髓损伤，证实联合治疗能够改善大鼠脊髓损伤灶和功能恢复，其机制可能与二氢睾酮激活BDNF信号通路，促进移植的ADSC的存活有关。

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(收稿2016-11-06)

Effects of DHT combined with ADSC transplantation on expression of BDNF and its receptor TrkB after spinal cord injury in rats

WangYing*，LiWenyuan，YinGuohua，LiZhigang，JinZaishun，TengChengyi，SunPing

*DepartmentofAnatomy，MudanjiangMedicalCollege，Mudanjiang157011，China

Objective To study the effects of dihydrotestosterone(DHT)and adipose-derived stem cell(ADSC)transplantation on expression and functional recovery of brain-derived neurotrophic factors(BDNF)and receptor TrkB after spinal cord injury in rats．Methods A total of 30 healthy SD rats were randomly divided into control group，ADSC group and DHT+ADSC group．BBB and electrophysiology were used to evaluate functional recovery．BDNF and TrkB protein were evaluated by Western blotting．Lesion area was observed by HE staining and the fluorescence signal of transplanted ADSCs which were labeled with PKH-26 was tracked by using immunofluorescence．Results Compared with ADSC group，the expressions of BDNF，TrkB and ADSC in DHT+ADSC group were markedly increased(P<0.05)．Compared with control group，ADSC group and DHT+ADSC group showed faster nerve conduction velocity，higher wave amplitude and shorter incubation period(P<0.05)．Additionallly，the DHT+ADSC group made more progress in terms of neural functional recovery and higher BBB index than ADSC group and control group(allP<0.05)．Conclusion DHT combined with ADSC transplantation which can improve injury and functional recovery may show superiority to simple ADSC treatment．The possible mechanism may be related to DHT up-regulate BDNF and TrkB expression in the lesion area in spinal cord and to promote ADSC survival．

Testosterone；Adipose-derived stem cell；Spinal cord injury；BDNF；TrkB

国家自然科学基金(81371362)；黑龙江省卫生计生委立项科研课题(2016-357)

R-332

A

1673-5110(2017)05-0017-04