HPLC-MS同时测定泽泻中两种泽泻醇的含量

池雨锋 ,王小明 ,张玲 ,林莎莎 ,蒋海强,周洪雷*

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2山东中医药大学实验中心，山东 济南 250355)



【中药与天然活性产物】

HPLC-MS同时测定泽泻中两种泽泻醇的含量

池雨锋1,王小明1,张玲1,林莎莎1,蒋海强2*,周洪雷1*

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2山东中医药大学实验中心，山东 济南 250355)

为提高泽泻药材的质量控制水平，建立了泽泻中23-乙酰泽泻醇B和24-乙酰泽泻醇A的高效液相-质谱联用含量测定方法。色谱条件为Halo C18色谱柱(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)，体积分数0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈为流动相，梯度洗脱，流速0.3 mL·min-1，柱温30 ℃；质谱条件为ESI离子源, 正离子检测方式，MRM模式，干燥气温度350 ℃，干燥气流速9 L·min-1，雾化器压力241.3 kPa，毛细管电压4 000 V。 测得药材中23-乙酰泽泻醇B和24-乙酰泽泻醇A含量分别为11.459 5 μg·g-1，321.823 9 μg·g-1。该方法结果准确，重现性好，可用于测定泽泻中两种成分的含量。

泽泻；泽泻醇；高效液相-质谱法；含量测定

泽泻为泽泻科植物泽泻Alismaorientalis(Sam.)Juzap 的干燥块茎。泽泻为常用中药，始载于《神农本草经》，并将其列为上品。泽泻为临床常用利水渗湿药，味甘、淡，性寒，归肾、膀胱经，能够泄热，利水渗湿、化浊降脂，临床上用于小便不利、水肿、高脂血症、热淋涩痛[1]。

泽泻所含有的化学成分主要是萜类，包括倍半萜、二萜、三萜，还有谷甾醇、硬脂酸、大黄素等[2]。现代药理研究表明，泽泻具有利尿、降血糖、降血脂、抗结石、抗肾炎、抗动脉粥样硬化等多种药理作用[3]。王立新等[4]发现泽泻的利尿有效成分主要是24-乙酰泽泻醇A，且泽泻中含有的23-乙酰泽泻醇B能够明显地降低血清中甘油三酯和总胆固醇含量[5-6]。许文等[7]对泽泻具有降糖活性部位化学成分进行研究，得到了多种三萜类成分，其中9种成分能够促进细胞对葡萄糖的摄取，推测三萜类物质是泽泻降糖作用的物质基础。尹仁杰等[8]认为23-乙酰泽泻醇B和24-乙酰泽泻醇A是泽泻利尿的有效成分，因此，这两种成分含量的高低在一定程度上决定了药材质量。本实验以这两种成分为指标，建立了泽泻的HPLC-MS测定方法，为科学评价泽泻质量提供依据。

1 实验部分

1.1 药材及试剂

泽泻药材(泽泻科植物泽泻Alismaorientalis(Sam.)Juzep. 的干燥块茎，原产地福建；批号：120906)，24-乙酰泽泻醇A(批号18674-16-3)及23-乙酰泽泻醇B(批号26575-95-1)购自北京宝赛希望生物科技有限公司，乙腈 (色谱纯，Fisher公司)；水为Milli-Q超纯水，其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器及色谱-质谱条件

仪器：Agilent 1260高效液相色谱系统，检测器：6420 QQQ质谱检测器。色谱柱：Halo C18(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)；流动相： 0.1%甲酸水- 0.1%甲酸乙腈体系(均为体积分数)，流速0.3 mL·min-1，柱温：30 °C。梯度洗脱条件：0 min，90∶10(0.1%甲酸水溶液∶0.1%甲酸乙腈溶液，下同)；12 min，70∶30；45～55 min,48∶52；75 min，28∶72。质谱条件：ESI离子源, 正离子检测方式，MRM模式，干燥气温度350 °C，干燥气流速 9 L·min-1，雾化器压力 241.3 kPa(35 Psi)，毛细管电压 4 000 V。MRM参数见表1。

表1 各离子对多反应监测(MRM)参数

1.3 对照品溶液的制备

分别精密称取24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B对照品粉末适量，乙腈超声溶解、定容使制成1.693 4 mg·mL-1的24-乙酰泽泻醇A储备液，0.426 6 mg·mL-1的23-乙酰泽泻醇B储备液，置于冰箱4 °C保存。测定时每种储备液分别取适量，制成混合对照品，混合对照品中24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B含量分别为0.423 3 mg·mL-1和0.106 6 mg·mL-1。

1.4 供试品溶液的制备

泽泻药材粉碎，精密称取10 g，10倍量95%乙醇回流提取3次，每次1 h，药渣再以10倍量水回流提取3次，每次1 h，过滤。醇提液60 ℃悬蒸回收乙醇，水提液60 ℃水浴蒸干，用甲醇转移并合并水提物和醇提物，定容至10 mL。甲醇液加适量甲醇稀释，超声30 min，经0.45 μm微孔滤膜过滤至进样瓶中，即得相当于原药材浓度为50 mg·mL-1的泽泻供试液。

2 结果

2.1 线性关系考察

采用逐步稀释法，至信噪比等于3时，浓度定为各成分检测限，24-乙酰泽泻醇A检测限为4.233 2 ng·mL-1，23-乙酰泽泻醇B检测限为42.660 0 ng·mL-1，信噪比等于10时的浓度定为定量限，二者定量限分别为14.110 7 ng·mL-1和142.200 0 ng·mL-1。精密吸取一定量的混合对照品溶液，用乙腈分别稀释至0、5、10、20、50、100倍。混合对照品浓度由低到高依次连续进样，以对照品溶液浓度(X，μg·mL-1)对峰面积(Y)进行线性回归，得回归方程：24-乙酰泽泻醇A，Y=8.460 1X+11 529.766 7，R=0.999 2，线性范围4.233 0～423.300 0 μg·mL-1；23-乙酰泽泻醇B，Y=2.194 7X+0.464 1，R=0.999 9，线性范围2.133 0～213.300 0 μg·mL-1。

2.2 方法学考察

精密度：以稀释20倍混合标准品溶液为样品，连续进样6次，根据峰面积考察精密度，24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B的相对标准偏差分别为1.56%和1.31%。

重复性：按照前述步骤，重复制备6份泽泻供试品溶液，根据两种成分含量考察重现性，24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B的相对标准偏差分别为1.59%和1.35%。

稳定性：按照前述方法制备一份供试品溶液，分别在 0、2、4、8、12、16、24 h 进样，以峰面积为指标，24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B的相对标准偏差分别为2.51%和1.89%，表明供试液在24 h之内稳定。

加样回收率：在已知成分含量的6份供试品溶液中分别定量加入两种对照品，每份测定2次，24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B的回收率分别为97.1%和98.6%。

2.3 样品测定结果

按照前述步骤，平行制备3份供试品溶液，按前述色谱质谱条件进行测定，色谱图见图1，结果见表2，1、2号色谱峰分别为24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B。

图1 泽泻样品MRM色谱图Fig.1 MRM chromatogram of Rhizoma Alismatis samples

序号23⁃乙酰泽泻醇B/(μg·g-1)24⁃乙酰泽泻醇A/(μg·g-1)样品111．5195324．8919样品211．3210318．8264样品311．5380322．2534平均值11．4595321．8239

3 讨论

泽泻作为中药在我国具有悠久的用药历史，历代本草均有收录，现今临床常用于治疗小便不利、水肿、高血脂症。泽泻中的三萜类成分不稳定，容易发生转化，文献报道，在贮存和炮制过程中，23-乙酰泽泻醇B会发生部分转化，转变成24-乙酰泽泻醇A和泽泻醇B，23-乙酰泽泻醇B含量有所降低，24-乙酰泽泻醇A含量明显增加，泽泻中的24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B是泽泻的主要活性成分[8-11]。因此，24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B的含量，在一定程度上决定了药材质量的高低，所以，仅以23-乙酰泽泻醇B作为指标评价泽泻药材质量是否合理，还需要进一步论证。

MRM参数的优化，通过全扫描获得母离子丰度，根据其丰度优化碎裂电压。然后，通过子离子扫描施加不同的碰撞能量使母离子发生裂解，对碰撞能量进行优化，以丰度最高的子离子为定量离子，丰度次之的子离子为定性离子，根据定量离子和定性离子的丰度优化碰撞电压，最终确定MRM参数。

目前，泽泻中萜类有效成分的含量测定方法，主要有紫外可见分光光度法和高效液相色谱法[12-14]，用高效液相-质谱联用方法测定有效成分含量的文章鲜有报道。紫外可见分光光度法能在一定程度上反映药材的质量，但是测定结果准确性偏低。高效液相色谱法多用紫外检测器，而泽泻中的有效成分紫外吸收较弱，只能利用波长较短的末端吸收进行测定，干扰因素多，误差相对较大。而高效液相-质谱联用方法具有测定结果准确重现性好的优点。本实验建立的HPLC-MS方法，用以测定泽泻中的24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B，为深入研究泽泻的质量标准提供了实验依据。

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Simultaneous determination of two alisols in Rhizoma Alismatis by HPLC-MS

CHI Yu-feng1,WANG Xiao-ming1,ZHANG Ling1,LIN Sha-sha1,JIANG Hai-qiang2*,ZHOU Hong-lei1*

(1.College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355，China；2.Experience Center of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355，China)

∶To improve the quality control of the Rhizoma Alismatis, a HPLC-MS method for determination of the contents of two alisols in Rhizoma Alismatis was established in this paper. Chromatographic conditions were as follows：Halo C18column(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm), the mobile phase was a mixture of 0.1% formic acid solution-0.1% formic acid in acetonitrile, gradient elution, the flow rate was 0.3 mL·min-1, the column temperature was 30 ℃. The conditions of MS included: ESI ion source, detection method with positive ions, mode by MRM, drying temperature was 350 ℃, the flow rate of drying gas was 9 L·min-1, pressure of nebulizer was 241.3 kPa, and the voltage of capillary was 4 000 V. The content of alisol B 23-acetate and alisol A 24-acetate in the samples was 11.459 5 μg·g-1and 321.823 9 μg·g-1, respectively. The method is accurate and reproducible to the determination of two alisols in Rhizoma Alismatis.

∶Rhizoma Alismatis; alisols; HPLC-MS; content determination

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.03.004

2016-08-12

山东省自然科学基金(ZR2015HM080)；山东省博士后创新项目专项资金(201403006)；山东省科技计划(2013GSF11903)；山东省高校中医药抗病毒协同创新课题(XTCX2014C01-03)

池雨锋(1989—)，男，硕士研究生，研究方向为天然药物化学成分。E-mail:chongming0539@126.com

*通信作者,蒋海强(1982—)，男，博士，副教授，研究方向为天然药物化学成分。E-mail: jhq12723@163.com； 周洪雷(1967—)，男，教授，研究方向为中药及复方活性成分与质量控制。E-mail:zhouhongleitcm@163.com

R284.1

A

1002-4026(2017)03-0017-04