原料乳显微镜直接细菌计数方法

朱毓华，潘波，毛勇，吴平

(娃哈哈集团有限公司质量监控部，杭州310018)

原料乳显微镜直接细菌计数方法

朱毓华，潘波，毛勇，吴平

(娃哈哈集团有限公司质量监控部，杭州310018)

通过对原料乳细菌数量采用显微镜直接细菌计数方法和国标GB478.2-2010菌落总数测定方法进行比较实验，确定了显微镜直接细菌计数方法和国标GB478.2-2010方法间良好相关性。结果表明，显微镜直接计数方法检测时间短，且检测成本低廉，可以作为原料乳验收的辅助方法使用。

原料乳；显微镜直接计数；细菌；快速方法

0 引言

原料乳细菌总数是衡量生牛乳原料的重要指标[1]。然而鲜乳的菌落总数指标按照GB478.2-2010方法进行检测需时48h，无法满足原料乳快速验收的要求。如果细菌超标的原料乳被用于加工生产，则为加工过程乃至终产品品质带来影响。

现今用于鲜乳快速计数的检测方法有显微镜检法[2-3]、流式细胞计数法45、还原实验法光电法[6]、电导分析法与阻抗分析法[7]、ATP荧光计数法[8-9]、PCR技术[10]。各种方法各有其优缺点，有的方法快速但成本昂贵，有的方法操作繁琐复杂。

显微镜直接计数法是基于光学显微镜观察方法，对视野中单个细菌、菌团、酵母、霉菌等微生物的直接计数方法。本文摸索生乳细菌直接镜检计数方法并与标准培养方法进行比对，现就该方法的具体情况做一阐述。

1 实验

1.1 材料与试剂

2016年5月和6月三次在娃哈哈公司奶源基地采集牛乳，每次采集牛乳10个左右，25室温保存直至检测，3次共计28个样品；0.1%吕氏碱性美蓝染色液；平板计数琼脂。

1.2 仪器与设备

超净工作台，高压灭菌锅，生化培养箱，漩涡震荡仪，显微镜。

1.3 方法

采用菌落总数计数和显微镜直接计数方法对同一样品，同时进行取样的模式进行检测。

1.3.1 菌落总数

参见GB4789.2-2010。

1.3.2 显微镜直接计数方法

（1）涂片。在载玻片上用标尺画1 cm×1 cm方框，用微量移液器吸取10 μL振荡后的牛乳，滴加至方框中央，并用无菌接种环将奶液涂匀使其平铺于方框内。

（2）风干。将涂布好的标本置于通风处吹干至完全干燥。

（3）固定。将玻璃染色支架放在沸水浴上，然后将干燥的涂片置于染色支架上。用蒸汽固定10 min以上。并风干。

（4）染色。取0.1%吕氏碱性美蓝染色液对标本进行浸染，染色时间为2 min。取出载玻片，用吸水纸吸取多余的染料，晾干。

（5）观察。油镜下观察细菌数，共计数20个视野细菌数量，最终求细菌数量平均值。

2 结果与分析

2.1 显微直接计数方法检测原料乳细菌总数的重复性

用显微直接计数方法计对细菌总数不同的28个奶样同时用两种方法进行多次检测，分析用显微直接计数方法检测原料乳细菌总数的可靠性，结果如表1所示。

表1 显微直接计数方法检测原料乳细菌总数的重复性

通过对细菌总数不同的奶样进行显微计数检测结果（表1）可知，所有数据变异系数都小于2%，说明使用显微计数方法重复性良好，计数平均值具有好的代表性。

2.2 两种方法检测牛乳细菌总数的比较

同时用显微直接计数方法与GB4789.2-2010对鲜乳菌落总数计数两种方法对细菌含量不同的28个鲜乳样品进行检测，结果（图1）表明，显微直接计数方法与GB4789.2-2010对鲜乳菌落总数两种方法间存在良好的线性关系，y=5625.2x+921.31，R2=0.9224。

2.3 显微直接计数方法结果

以美兰为染色剂的显微直接计数方法所观察到的样品呈现蓝色背景，其中脂肪球在显微镜下形成明亮的小滴，有强烈的折射光，由于光学现象所致，每个脂肪球表面如有层膜包覆。所有微生物包括细菌和酵母等形态微生物被染上较深的蓝色，其在视野中以较清晰的形态存在，如图2所示。

图1 两种检测方法的线性关系

图2 显微直接计数方法图片

3 结论

本研究所采用直接计数方法是以显微镜观察为基础，通过制片、染色和观察等几个简单的步骤直接对样品中细菌数量进行计数方法：

（1）从实验结果可知，运用显微镜直接计数方法检测原料乳细菌总数与国标方法具有良好的线性（R2=0.9224）。（2）显微计数时视野的选择需要选择微生物分布均匀的视野，需要一个个计数，不管两个相连或成堆成链，均需一个个计数，菌团按一个计数；并在本研究中发现当视野内细菌数量过多时，计数的准确性明显降低。（3）该方法的优点为能够在20 min内完成原料乳中的细菌总数的检测，与GB4789.2-2010方法相比，可以改善由于传统国标方法培养48h出结果所造成的细菌总数过多而已经投入使用的状况。（4）与FOSS等细胞计数仪相比，该方法验收且成本低廉，是一种值得推广的新型技术。

[1]郭本恒.乳品微生物学[M].北京：中国轻工业出版社，2007，23-35.

[2]杜茂昌.利用显微镜直接计数快速检验鲜乳细菌总数研究[J].食品科学,1983(12):46-48.

[3]徐尔尼.细菌显微直接计数法用于乳粉生产中半成品乳杂菌总数的快速检验[J].食品工业科技,1996(3):81-82.

[4]THUSITHA S，PAUL V，DUNCAN A V,et al.A flow cytometry method for rapid detection and enumeration of total bacteria in milk [J].Applied and Environmental Micorbiology,2005,66(3):1228-1232.

[5]王宁，刘宁.细菌显微直接计数法用于乳粉生产中半成品乳杂菌总数的快速检验[J].食品工业科技,2007,28(9):197-200.

[6]许振伟.实时光电微生物法快速检测生鲜乳中的嗜冷菌[J].现代食品科技，2012,28（12）1792-1795.

[7]COOMBS P,MARLATT F．Conductance microbiology in the dairy industry[M]．Food and Beverage Technology International USA, 1989:209-211.

[8]孔保华.乳品科学与技术[M].北京:科学出版社，2004：115-125.

[9]田丽萍,吴志良,孟庆红，等.两种原料乳细菌总数检测方法的比较[J].乳业科学与技术，2011,147（2）77-78.

根据上述实验方案对A1B3C2与A1B3C3进行2次实验，A1B3C2得最终平均离心率为0.487%，A1B3C3得最终平均离心率为0.484%，两组实验结果非常接近，且观察21 d后，两组产品沉淀非常少，析水约0.3 cm，从经济效益的角度考虑，选择A1B3C2较为适宜。

3.6 感官评价结果

通过品尝乳酸菌饮料的口感，从酸甜度、清爽度、外观、整体喜好度挑选出最喜爱的样品。由表2可以看出，9组样品中1～6号样品总体评价较高，7～9号样品感官评价相对较低。且通过观察，记录临界期21 d的析水情况，1号、2号、4号、7号、8号、9号实验方案析水较多，约0.8～1.0 cm，且沉淀多；其他几组3号、5号、6号实验方案析水较少，约0.3～0.5 cm，沉淀少，这与正交实验的结果也是相符的。

3.7 结论

综上所述，使用纯净水配制，在pH值为3.6的条件下，以大豆多糖添加量0.25%、果胶添加量0.3%为复配稳定剂，制作褐色活性乳酸菌饮料，蛋白质质量分数≥1.0%，风味好，酸甜适宜，且在保质期21 d内稳定性良好，无明显沉淀与水析出，是一款符合产品品质要求的产品[8]。但由于实验条件的限制，没有对水质电导率进行深入研究，并且在后续还会对褐色饮料工艺进行研究，进一步优化产品。

参考文献：

[1]潘丽红,姚林宏,吴菊清,等.简述美拉德(Maillard)反应[J].中国调味品,2008,33(4):25-27.

[2]董涛,张国松,周玉玲.养乐多风味乳酸菌饮料生产工艺的探讨[J].中国乳品工业,2005,33(4):40-41.

[3]蒲金平.可溶性大豆多糖和大豆膳食纤维在乳制品中的应用研究[D].华东师范大学,2014.

[4]杨晓泉,齐军茹,司华静,等.大豆多糖的研究进展及在含乳饮料、米面等食品上的应用[J].中国食品添加剂,2008(3):135-139.

[5]曾令平,常忠义,高红亮.水溶性大豆多糖和果胶作为酸性乳饮料稳定剂的研究[J].中国乳品工业,2008,36(11):25-28.

[6]盛林霞,卢蓉蓉.高酯果胶和水溶性大豆多糖及其复配对酸性脱脂乳饮料稳定性的影响[J].2015.

[7]刘丽,蔡云升.调配型酸乳饮料稳定剂及其稳定性的研究[J].食品工业科技,2003,24(5):63-65.

[8]GB/T 21732-2008含乳饮料[S].

[10]SHAMA G,MALIK D J.The uses and abuses of rapid bioluminescence-based ATP assays[J].International Journal of Hygiene and En⁃vironmental Health,2013,216(2):115-125.

Direct microscopy of raw milk bacteria count methodology

ZHU Yuhua，PAN Bo，MAO Yong，WU Ping
(The quality monitoring department，Wahaha Group Co.Ltd.，Hangzhou 310018，China)

The number of bacteria in raw milk by the total number of bacteria microscope counting method and GB 4789.2-2010 total na⁃tional food safety standards of food microbiology testing colonies determination were compared，found that there are good correlation be⁃tween direct microscope bacterial count method and GB478.2 method.The experiment found that the microscopic counting method has the characteristics of short detection time，low detection cost，can be used as an auxiliary method for inspection of raw milk.

raw milk;microscope counting;bacteria;rapid method

Q93-332

A

1001-2230（2017）05-0051-02

2016-06-01

朱毓华(1980-)，女，工程师，从事食品微生物质量检测工作方向。