聚集蛋白多糖在瘢痕疙瘩中的表达研究

赵竞伊　靳小雷　宗宪磊等

[摘要]目的：探讨聚集蛋白多糖（Aggrecan）在瘢痕疙瘩中的表达和意义。方法：临床收集瘢痕疙瘩及正常皮肤组织标本各10例，采用免疫组织化学技术及蛋白印迹方法检测其中Aggrecan的表达，并对结果进行统计学分析。结果：Aggrecan在瘢痕疙瘩及正常皮肤组织中皆有表达，但在瘢痕疙瘩中表达明显增高，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：聚集蛋白多糖在瘢痕疙瘩组织中表达增高，提示其可能参与瘢痕疙瘩形成过程。

[关键词]聚集蛋白多糖；瘢痕疙瘩；细胞外基质；表达

[中图分类号]R619⁺.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）03-0077-03

瘢痕疙瘩（Keloid，KD）是一种特殊病理性瘢痕，具有肿瘤侵袭性、生长超出原始损伤范围、不易自行消退、单纯切除易复发等特点，影响美观的同时伴随着瘙痒、疼痛等不适，给患者身心带来巨大痛苦。目前瘢痕疙瘩发病机制尚未完全明确，缺乏可靠有效的治疗手段，是各学者研究的热点和难点。其中瘢痕疙瘩特异性蛋白及分子标志物，因其既可作为探讨病理性瘢痕发生发展机制的突破点，又可作为其诊治疗效的检测指标，受到了广泛的关注。本研究团队前期通過采用蛋白质组学技术对瘢痕疙瘩蛋白进行定量标记检测研究，分析其与正常皮肤的表达差异，建立了瘢痕疙瘩差异蛋白谱，发现聚集蛋白多糖（Aggrecan）在瘢痕疙瘩中表达上调较明显，现采用免疫组织化学技术及蛋白印迹（Western blot）进行验证，报道如下。

1材料和方法

1.1一般资料：所有标本取自我科2014年-2015年门诊及住院患者整形手术切除的组织。瘢痕疙瘩患者，男4例，女6例；年龄24～56岁，平均37岁；患处分别为胸部4例，肩部4例，下颌2例；病程10个月～19年，平均6.3年。诊断标准为：①病程超过9个月而无自发消退征象；②皮肤损害超过原有损伤范围并向周围正常皮肤侵犯；③以前曾行手术切除或冷冻、激光、激素封闭或放疗等而又复发者。所有患者均已依靠临床表现及病理检查确诊。正常皮肤标本取自整形外科手术中切取的正常皮肤组织（Normal skin，NS），男3例，女7例；年龄28～54岁，平均32岁；取样部位分别为面部6例，四肢4例。所有组织切取后分成两部分，一份经液氮速冻，-80℃保存；一份加入福尔马林溶液固定。所有患者均签署科研知情同意书。

1.2实验仪器与试剂：倒置相差显微镜（Nikon公司）、组织切片机RM2135（Leice公司）、PHY-IU病理组织漂烘处理仪（常州中威电子仪器厂）、“Tissue-Tek”TEC组织包埋机、2U2-EO型台式干燥箱（南通科学仪器厂）、组织匀浆机、分光光度计（德国Eppendorf生物公司）。二步法免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）、蛋白裂解液（碧云天生物技术研究所）、鼠抗人Aggrecan一抗（英国Abcam公司）、鼠抗人β-Actin一抗（北京中杉金桥技术有限公司）。

1.3实验方法

1.3.1免疫组织化学染色：将福尔马林固定后的瘢痕疙瘩及正常皮肤组织取材，切成约1cm×0.5cm×0.2cm的小块后包埋，组织蜡块4 μm连续切片，二甲苯脱蜡，无水乙醇逐步水化，抗原修复，采用二步法免疫组化染色，严格按说明书进行操作。Aggrecan一抗按1：100稀释，以PBS缓冲液替代一抗作为阴性对照，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。Aggrecan染色以细胞核或细胞质出现黄色或棕褐色颗粒为阳性。

1.3.2 Western Blot检测：用总蛋白提取试剂盒分离蛋白，-80℃储存，备用。以BCA方法检测蛋白含量：50 μg总蛋白量在10%SDS-PAGE中电泳分离，并电转至PVDF膜，加入Aggrecan一抗，4℃孵育过夜，以辣根过氧化物酶结合的抗小鼠二抗（1：10000）室温孵育1h后，采用Super-signalWest Picokit（Pierce）化学发光试剂盒和X线胶片显示特异性蛋白条带，以β-actin蛋白为内参对样本的蛋白含量进行校准和半定量分析。

1.4统计学方法：采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，用独立样本t检验对检测结果进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1免疫组化学染色：两组样品染色后，显微镜下观察，瘢痕疙瘩组织和正常皮肤组织的表皮层、真皮层细胞都有Aggrecan表达，其主要表达于细胞核中，表皮细胞、真皮成纤维细胞、毛囊细胞、汗腺细胞及血管内皮细胞的细胞核都有表达（图1）。比较瘢痕疙瘩组织和正常皮肤组织免疫组化染色阳性灰度值（Integrated option density，IOD），瘢痕疙瘩组织阳性灰度值与正常组织相比显著增高（P<0.05）。

2.2 Western Blot检测：检测结果显示，瘢痕疙瘩组织中Aggrecan蛋白表达水平明显高于正常皮肤对照组，进行半定量分析显示其蛋白表达差异有统计学意义（P<0.05，图2）。

3讨论

瘢痕疙瘩组织学特点为大量成纤维细胞（Fibroblast，FB）增生，细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）中胶原、蛋白多糖、糖蛋白等过度沉积、胶原纤维排列紊乱。大量研究表明，瘢痕疙瘩组织中ECM的数量和成分较正常皮肤组织有明显改变。ECM能够影响FB的形态、迁移、增生、分化和代谢，与细胞因子相互作用影响FB生物学功能，对瘢痕疙瘩的发生发展有明显的调节作用。

蛋白多糖作为ECM的重要成分之一，在皮肤创伤愈合、组织修复、肿瘤发生等方面都起着至关重要的作用，目前蛋白多糖家族中的多种因子作为病理性瘢痕特异性分子标志物研究受到了广泛关注。

细胞外基质中蛋白多糖主要包括两大家族成员——大分子聚合硫酸软骨素蛋白聚糖（the Large Aggregating Chondroitin Sulfate Proteoglycans，Lecticans）和小富亮氨酸蛋白聚糖（Small Leucine-rich Proteoglycans，SLRPs）。其中，小分子蛋白多糖家族中的核心蛋白多糖（decorin）、双糖链蛋白多糖（biglycan）等都已经被研究证实与瘢痕疙瘩发生发展相关。而Lecticans家族的多功能蛋白聚糖（versican）也是目前研究较为深入的一类细胞外基质蛋白多糖，它通过TGF-β₁相关调控途径参与了病理性瘢痕的发生过程，促进了成纤维细胞的生长、增殖及胶原合成。与正常皮肤相比，versican在瘢痕疙瘩及增生性瘢痕的真皮网状层中显著高表达。

聚集蛋白聚糖（Aggrecan）是Lecticans家族的经典成员之一，是主要表达于透明软骨组织中的一种软骨素硫酸化蛋白多糖。目前对Aggrecan的研究主要集中于其在骨、软骨发育中的作用以及其与中枢神经系统的关系上，探讨其在皮肤增生性疾病中的表达及意义方面的研究很少。其主要特性是能够在连接蛋白的帮助下牢固结合细胞外基质重要分子透明质酸（Hyaluronic Acid，HA），从而形成大分子Aggrecan聚合体。早有研究证明HA在瘢痕疙瘩成纤维细胞及表皮中表達显著升高，这可能与Aggrecan形成大分子聚合体有关。Shih B的研究也发现了Aggrecan在瘢痕疙瘩内部组织中的表达显著高于其与正常皮肤交界部位的皮肤，从另一个方面也证实了Aggrecan可能与瘢痕疙瘩的增生有关。

瘢痕疙瘩作为一种发病机制尚未明确的皮肤疾病，其发生发展过程中存在各种表达异常，过表达或表达不足的细胞因子相互影响，形成复杂的蛋白质相互作用网络，参与了瘢痕疙瘩的发病，因此开展对瘢痕疙瘩相关因子及标志物的深入研究，进一步明确其内部的联系，筛选出某种或某类对瘢痕疙瘩具有高度特异性的标志物应用于临床，对瘢痕疾病早期快速诊断及有效治疗均有重要意义。本文在前期采用蛋白质组学技术对瘢痕疙瘩蛋白进行定量标记检测研究发现聚集蛋白多糖在瘢痕疙瘩中表达上调较明显的基础上，采用免疫组织化学技术及蛋白印迹进行验证，进一步证实了聚集蛋白聚糖在瘢痕疙瘩组织中表达水平明显高于正常皮肤对照组，提示聚集蛋白多糖在瘢痕疙瘩发病中具有一定的作用，为深入开展瘢痕疙瘩发病机制的研究增加了新的内容。