当归补血汤对病毒性心肌炎小鼠心肌保护作用及对心肌组织血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响*

邝志斌

(遵义医学院第五附属(珠海)医院心内科，广东 珠海 519100)

病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)是由亲心肌病毒感染导致的心肌局限性或弥漫性炎症疾病[1]，最常见的病原是柯萨奇病毒B3(coxsackie virus B3，CVB3)。VMC感染心脏会通过多种机制产生心肌损伤[2-3]，已经成为严重危害人类(特别是儿童和青壮年)健康的心血管系统疾病。当归补血汤是补气补血的经典名方之一，由黄芪和当归以5∶1组成，临床上用其治疗白细胞、血小板减少症，疗效显著[3]。本研究通过比较不同处理组小鼠血清中血清乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血清磷酸激酶同工酶(CK-MB)的含量以及小鼠心肌组织血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达量，进一步探讨当归补血汤对VMC小鼠心肌的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄芪、当归(均取自本院中药房)，8周龄雄性BALB/C小鼠60只，体质量(20±2)g(动物购自广州中山大学动物试验中心)，CVB3病毒液(购于吉林大学再生医学研究所)，LDH试剂盒、AST试剂盒、CK-MB试剂盒(购自南京建成)，苏木素染色液、伊红染色液、RIPA蛋白裂解液(广州艺佳生物)，VEGF单克隆抗体、羊抗小鼠IgG二抗(广州优迪生物)，ECL发光液(南京凯基)，倒置显微镜(明美)。

1.2 实验方法

1.2.1 中药制备 当归补血汤以5∶1比例组成，药物组成(均系干品)为黄芪30 g，当归6 g，浸泡2 h，先后加400 mL和200 mL自来水煮沸1 h和30 min，合并两次药液，纱布过滤，蒸发浓缩至30 mL得50%当归补血汤水煎剂。人体口服推荐量为30 mL/d，成人体重按60 kg计算，折合剂量0.5 mL/kg·bw，当归补血汤口服液低、中、高剂量分别2.5 mL/kg·bw、5.0 mL/kg·bw、15.0 mL/kg·bw(分别相当于人体推荐剂量的5、10、30倍)。取当归补血汤口服液25.0 mL、50.0 mL、150.0 mL加蒸馏水至200 mL，配成低、中、高剂量所需浓度。每天灌胃1次，灌胃体积为0.2 mL/10 g·bw，对照组予以等体积的生理盐水，连续12 d。

1.2.2 模型制备：健康BALB/C小鼠，18～22g，共60只，随机将60只小鼠分为正常组和模型组、当归补血汤口服液低、中、高剂量组，每组12只。除正常组，各组小鼠均腹腔接种含100TCD50的CVB3病毒液0.1 mL，常规饲养，存活72 h以上小鼠为VMC模型。正常对照组小鼠腹腔接种等量不含病毒的Eagle氏液。当归补血汤口服液组以灌胃方式连续给药12 d。对照组小鼠给予相同体积的蒸馏水。自感染病毒日起 ，逐日观察小鼠发病和死亡情况。

1.2.3 动物取材：每组随机取小鼠6只，第13 d以10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，静置30 min，3000 r/min，离心15 min，分离得血清；将小鼠颈椎脱位，处死后取出小鼠心脏横断为两部分，取上半部分心肌，用于HE染色及免疫组织化学染色。将下半部分去掉右心室心肌后，取30 mg心尖部心肌放入超低温冰箱(-80℃)，用于Western印迹法检测。

1.2.4 小鼠血清LDH、AST、CK-MB含量测定：取小鼠血清严格按照LDH、AST、CK-MB试剂盒说明用自动生化分析仪测定其活性。

1.2.5 常规HE染色：取小鼠上半部分心肌放入4%多聚甲醛固定、流水冲洗，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡及包埋等步骤后，制作5 μm 厚度切片，切片经脱蜡、水化后，苏木素染色3 min，在1%盐酸-乙醇中分化，自来水中返蓝30min，1%伊红染色1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.6 免疫组织化学染色：将组织切片脱蜡、水化，微波修复，3%的H2O2孵育，小鼠来源的VEGF 单克隆抗体(1∶500)作为一抗，应用免疫组织化学染色技术(Elivision法)进行染色，DAB显色，苏木素核复染。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。染色中以PBS 代替一抗作空白对照。

1.2.7 Western 印迹法：取30 mg心尖部心肌于冰浴上(4℃)，将心肌组织剪碎，加RIPA蛋白裂解液599 μL及苯甲基磺酰氟1 μL匀浆，超声破碎后，在4℃下以离心半径9.35 cm，12 000 r/min，离心40 min 取上清液，将样品置于深冻冰箱(-80℃)保存，按试剂盒操作说明书提供方法测定蛋白浓度。将样品中加入5×上样缓冲液，上样总体积为15 μL，上样总蛋白量为80 μg，变性后，进行12% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。湿转法将蛋白转移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。用5%脱脂牛奶封闭，小鼠抗大鼠VEGF单隆抗体 (1∶200)孵育，4℃过夜。TBST缓冲液洗涤，多克隆山羊抗小鼠IgG二抗(1∶2000)室温孵育，TBST缓冲液洗涤，滴加ECL发光剂进行发光。使用ImageJ软件分析各个条带的灰度值。

2 实验结果

2.1 各组小鼠生存情况

模型组小鼠于接种病毒后3 d活动量减少，出现对刺激反应淡漠，6～7 d左右出现对刺激反应差或嗜睡，后肢瘫痪及共济失调，11～12 d左右四肢肿胀，对刺激反应极差，甚至死亡，具体统计情况见表1。模型组及各服用当归补血汤口服液组的小鼠生存率与正常组差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 接种VMC病毒12天后各组小鼠生存率

2.2 免疫组化结果

通过免疫组化观察VEGF的表达，结果见图1。对免疫组化结果进行光密度分析，结果见图2。由图2可以看出，小鼠感染VMC病毒后，VEGF表达量显著低于正常组。在给予当归补血汤的治疗后，低、中、高剂量组小鼠内VEGF的表达量呈现上升趋势,且各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 不同处理组免疫组化图

图2 免疫组织病理分析

2.3 小鼠血清LDH、AST、CK-MB表达量测定

模型组小鼠在感染VMC病毒后，血清LDH、AST、CK-MB表达量急剧上升，与正常组存在显著差异(P<0.05)。在灌胃高剂量当归补血汤后，LDH、AST、CK-MB表达量均显著降低，其中CK-MB的表达量与正常组无明显差异。见表2。

表2 血清LDH、AST、CK-MB含量测定±s)

注：a模型组与正常组比较P<0.05；b不同剂量当归补血汤组与模型组比较P<0.05。

2.4 VEGF表达量检测

利用Western blot：检测VEGF表达量见图3。由下图可以看出，正常组小鼠VEGF的表达量显著高于模型组小鼠；而在给感病小鼠灌胃低、中、高三份不同剂量的当归补血汤后，小鼠内VEGF的表达量逐渐上升，高于模型组，低于正常组。见图3。

图3 western blot 检测VEGF表达量注：图A为蛋白条带图，1～5分别为模型、正常、低、高、中组。图B为灰度分析。

3 讨论

VEGF也称血管渗透因子，是1989年Ferrara在牛垂体滤泡星状细胞培养液中析出的一种糖蛋白。其具有多种生理效应，包括促进血管生成，舒张血管，提高血管通透性，促进细胞增殖、分化及提高细胞生存力等。大量研究表明VEGF参与心血管疾病的发生发展过程，关于在心血管疾病中的发病机制及临床应用的研究也日益受到关注。VEGF是一种有丝分裂原，能结合、激活两个主要的内皮特异性受体：KDR 和FIT-1。KDR和FIT-1可以激活内皮细胞的许多信号传导通路，以此来激活内皮细胞的增生、迁移和一氧化氮合酶(NOS)的释放，调节细胞增生、迁移、分化和凋亡，影响机体的心血管系统，促进内皮细胞增殖及侧支循环的生成及受伤后组织的修复。

心肌炎(myocarditis)是心肌本身的炎症病变，可分为感染性和非感染性两大类。感染性可由细菌、病毒、螺旋体、立克次体等病原微生物引起。其中VMC的发病率较高。非感染性由过敏、化学、物理或药物等因素引起。VMC是病毒在心肌细胞内复制从而引起心肌细胞溶解并引发一系列心肌组织的自身免疫反应。何学华等[4]研究显示，VMC心肌组织VEGF mRNA呈现高表达状态，可能是由于发生心肌炎时，一方面炎性细胞浸润、内皮细胞肿胀、广泛的血管痉挛引起血管管腔狭窄甚至闭塞；另一方面有病原体对血管的直接损伤，这些均导致继发性心肌缺血缺氧的发生，从而刺激VEGF生成增加，并且随着炎症细胞增加，其分泌的VEGF亦增多。另外，从骨髓动员的干细胞亦分泌大量VEGF。有研究表明早在CVB3感染后第3 d，即有心肌细胞和血管内皮细胞的增殖[5]，提示VEGF在早期即促发了心脏修复工程。Plttenger等的研究发现，即在急性VMC的早期阶段，细胞因子和炎症细胞会触发损伤的修复过程，且提示VEGF可能参与了这一修复过程。

当归补血汤是金元时代李东垣所创造的益气补血方剂，由黄芪和当归两味药以5∶1比分组成，具有益气生血功效，多用于治劳倦内伤，气血虚，阳浮于外之虚热证。临床上关于当归补血汤的研究很多，岳运霞等在研究不同浓度当归补血汤膜提取物对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响中发现当归补血汤膜提取物能明显促进鸡胚绒毛尿囊膜血管新生。刘清君等[6]在探讨当归补血汤治疗缺血性疾病的作用机制时指出这可能与当归补血汤超滤膜提取物能够明显促进鸡胚绒毛尿囊膜血管新生有关。杨丽霞等[7]在对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型的研究中发现当归、黄芪注射液在1:5 的配伍时促进CAM 血管生成作用最强，其可能的机制是血管内皮细胞的增殖与迁移。王嫔等[8]研究表明当归补血汤具有显著的促进衰老心肌梗死大鼠冠状动脉侧枝血管生成作用，其作用机制可能与提高VEGF、NO水平有关。

在心血管领域，对当归补血汤的研究主要在缺血性心脏病方面，而对VMC心肌组织VEGF的影响则报道尚少。本实验拟对VMC小鼠模型采用不同剂量的当归补血汤干预，观察记录VMC小鼠心肌组织VEGF的免疫组织化学染色及 Western 印迹法检验结果，从而评价当归补血汤对VMC小鼠心肌的保护作用及对心肌组织VEGF的影响。

[1] 孙景辉，翟淑波.病毒性心肌炎发病机制的研究进展[J].临床儿科杂志，2012，30(7)：607-612.

[2] BLAUWET L A,COPPER L T.Myocarditis Progress in cardiovascular diseases[J].2010(52):274-288.

[3] ROSE N R.Myocarditis infection versus autoimmunity[J].Journal of Clinical Immunology.2009(29):730-737.

[4] 何学华，李文娟，袁勇华，等.黄芪与VitC对病毒性心肌炎小鼠心肌血管内皮生长因子的影响[C]，中华医学会第十七次全国儿科学术大会论文汇编(上册)，2012.

[5] LIN Y，ZHAI E，LIAO B.Autocrine VEGF signaling proliferation through a PLC-dependent pathway and modulates Apatinib treatment afficacy in gastric cancer[J].Oncotarget,2017.

[6] 刘清君，李应东.当归补血汤超滤膜提取物对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2008，6(4)：420-421.

[7] 杨丽霞，豆伍应，颜春鲁，等.当归、黄芪注射液对鸡胚绒毛尿囊膜模型的毒性研究[J]，中国实验方剂学杂志，2009，15(5)：46-48.

[8] 王嫔，李丹，田昕.当归补血汤对衰老心肌梗死大鼠冠状动脉侧枝血管生成的影响及其机制[J]，医药卫生科技，2016(7)：214-216.