高效液相色谱法测定八宝粥罐头中乙二胺四乙酸二钠含量的不确定度评定

刘四磊，赵 允，戴绚丽，吴 平

杭州娃哈哈集团有限公司 (杭州 310018)

高效液相色谱法测定八宝粥罐头中乙二胺四乙酸二钠含量的不确定度评定

刘四磊，赵 允，戴绚丽，吴 平

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根据JJF1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》的原理与方法，建立了高效液相色谱法测定八宝粥罐头食品中乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)含量的测量不确定度评定的数学模型。对数学模型中各不确定度分量的来源进行分析、量化和合成。当取样量为2.0 g时，其测定的乙二胺四乙酸二钠含量为(162.600±3.578) mg/L。最终结果的不确定度主要由标准溶液、样品处理过程中回收率及标准曲线的建立引起。整体评定方法清晰合理，简便准确，可为实验室在该检测过程中进一步提高检测数据的可靠性和一致性作参考。

乙二胺四乙酸二钠；不确定度；液相色谱；八宝粥罐头

乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)具有很高的稳定常数，能够与绝大多数金属离子在微剂量下发生络合反应形成稳定的化合物，能消除金属离子或由金属离子诱导产生的破坏食品感官性能的影响[1]。在GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》中规定其作为稳定剂、凝固剂、抗氧化剂、防腐剂，允许使用于果酱，果脯、腌制蔬菜、罐头、饮料等9类食品中[2]。利用EDTA-2Na较强的络合作用，可有效阻止或延缓食品褪色、氧化、变质，与防腐剂能表现出理想的协同作用，具有良好的抗菌活性[3]。然而过多的摄入EDTA-2Na会导致人体微量元素的损失，从而诱发一系列的疾病，因此，国内外对EDTA-2Na制定了严格的限量要求，每日允许摄入量为0～205 mg/kg。我国在杂粮罐头食品中规定其最大使用量不得超过250 mg/kg[2]。

目前，国内外关于食品中EDTA-2Na的检测方法有很多，主要有反相-高效液相色谱法(RP-HPLC)[4]、气相色谱法[5]、离子色谱法[6]、分光光度法[7]、毛细管电泳法[8]、液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS)[9]。其中HPLC法检测过程中较多文献采用CuCl2作为衍生化试剂，但和EDTA-2Na络合后产物并不稳定，尤其是对样品基质干扰较大的罐头类食品，当基质中含有Fe3+时检测结果将不准确，难以满足限量要求[10]。因此，有必要研究复杂基质类食品中EDTA-2Na的检测方法，来满足食品添加剂中规定的限量要求。

不确定度是指由于测量误差的存在，造成测量值不能被确定的程度，是衡量测量结果质量可靠性和准确性的重要参数[11]。通过对不确定度的评定，一方面可以给出测量结果的可信程度，另一方面，可以使测量结果在国际和国内不同检测机构间进行量值比对和实验室间数据共享。GB/T 27025—2008《检测和校准实验室能力的通用要求》指出，当检测结果处于标准要求的临界值，有可能判定被检产品不合格时，应给出测量不确定度。目前，有关食品中EDTA-2Na的测量不确定度评定，国内外未见相关报道。本文根据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》要求，通过分析检测过程中影响检测结果稳定性的主要影响因素，评定测定过程中不确定度的来源，建立了HPLC测定八宝粥罐头食品中EDTA-2Na含量的不确定度评定方法。旨在为食品企业测定EDTA-2Na含量进行质量控制提供理论基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈(色谱纯)，德国Merck 公司；10%四丁基氢氧化铵(分析纯)，上海展云化工；三氯化铁(分析纯)，天津科密欧化学试剂；EDTA-2Na标准品(色谱纯)，美国Sigma-Aldrich公司；磷酸(分析纯)，南京奥佳化工。

1.2 仪器与设备

Waters HPLC(配有四元泵、柱温箱、自动进样器、可变波长紫外检测器及Empower 3化学工作站数据处理系统)，美国Waters公司；Beckman Avanti J-26XP 高速冷冻离心机，美国Beckman；Milli-Q Advantage A10超纯水机，美国密理博公司；Sartorius电子天平(CP225D)，德国赛多利斯公司；IKA T25组织捣碎机，德国IKA公司。

1.3 试验条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：称取1.15 g磷酸二氢铵，加水溶解至900 mL，加入8 mL 10%四丁基氢氧化铵溶液，经0.45 μm滤膜抽滤后加100 mL的乙腈，用磷酸调pH至2.42；流速：0.7 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：254 nm；进样量：10 μL。

1.4 试剂与标准溶液配制

EDTA-2Na标准溶液：准确 0.1 gEDTA-2Na固体标准品，用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，得浓度为1.0 mg/mL的标准储备溶液，此溶液转移至储液瓶中4 ℃下储存。

EDTA-2Na标准系列溶液：分别吸取 50、100、200、400、800、1000 μL的EDTA-2Na标准溶液于10 mL 容量瓶中，加入1 mL浓度为0.02 mol/L的三氯化铁溶液，混合均匀，于超声条件下超声20 min，冷却至室温后，用水定容至刻度，充分混合均匀后，过0.45 μm滤膜，供上机检测。

1.5 样品前处理

准确称取2.0 g左右经均质器粉碎混匀的八宝粥罐头样品，加4 mL水稀释后加入1 mL浓度为0.02 mol/L的三氯化铁溶液，混合均匀，于超声条件下超声20 min，冷却至室温后，用水定容至刻度，充分混合均匀后，以8 000 r/min离心5 min，过0.45 μm滤膜，供上机检测。

2 结果与讨论

2.1 数学模型的建立

本实验中，八宝粥罐头中EDTA-2Na含量的测量数学模型：

式中：X为样品中EDTA-2Na的含量，mg/kg；A为样液中EDTA-2Na衍生物的峰面积；C为标准工作液中EDTA-2Na衍生物的浓度，mg/L；V为样液最终定容体积，mL；f为回收率校准因子；As为标准工作液中EDTA-2Na衍生物的峰面积；m为试样称样量，g。

依照以上数学模型，本测量结果的不确定度主要来源有：配制EDTA-2Na标准溶液引入的不确定度ur(x1)、样品称量产生的不确定度ur(x2)、样品定容体积引入的不确定度ur(x3)、样品重复测定产生的不确定度ur(x4)、样品处理过程中回收率引入的不确定度ur(x5)和最小二乘法拟合标准曲线求样品质量浓度所引入的不确定度ur(x6)。

2.2 各不确定度分量的评定

2.2.1 配制EDTA-2Na标准溶液产生的相对不确定度ur(x1)

2.2.1.1EDTA-2Na标准物质引入的不确定度ur(x1.1)

2.2.1.2 EDTA-2Na标准物质称量引入的相对不确定度ur(x1.2)

2.2.1.3 EDTA-2Na标准工作溶液配制过程中器量校准引起的相对标准不确定度ur(x1.3)

因此，EDTA-2Na标准工作溶液配制过程中器量校准引起的相对标准不确定度：

因此，EDTA-2Na标准物质配制引入的不确定度ur(x1)为：

2.2.2 样品称量产生的不确定度ur(x2)

2.2.3 样品定容体积引入的不确定度ur(x3)

样品最终定容体积使用10mL容量瓶，其所引入的相对标准不确定度为：

2.2.4 样品重复测定产生的不确定度ur(x4)

重复性测定不确定度主要是由实验操作人员技能水平、检测仪器的分辨率和稳定性、样品的混合均匀程度等因素引起的。按上述实验方法平行测定样品6次，测定结果及计算数据见表1。

表1 样品重复测量结果

2.2.5 样品处理过程中回收率引入的不确定度ur(x5)

回收率可以用来确定样品处理方法、分析方法等产生的偏差。本实验通过加标回收率来进行不确定度的评定。分别完成0.8、1.0、1.2倍的目标物含量3个水平的添加，每个添加水平做2个重复，计算回收率。回收率范围 97.3%～100.67%，平均回收率为 98.51%，见表2。

表2 样品回收率测定值

标准不确定度采用平均值的标准偏差，标准不确定度和相对标准不确定度分别为：

同时，必须对平均回收率进行显著性检验，以确定回收率校正因子f是否在计算公式中采用[14]。t检验是用t分布理论来推论差异发生的概率，从而比较两个平均数的差异是否显著。本实验用t-检验确定加标平均回收率与100%有无显著性差异，设显著水平为α=0.05，t1-0.05(n-1)=1.943(n=6)，则，

由于平均回收率与100%差异显著，因此必须考虑回收率引入的不确定度。

2.2.6 最小二乘法拟合标准曲线求样品浓度产生的相对标准不确定度ur(x6)

测定过程中采用了1 000mg/L的标准储备液配制了6种浓度(5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、100mg/L)的标准溶液，分别上机测定3次，得到相应的峰面积，检测结果见表3。根据检测结果，采用最小二乘法拟合，得出标准工作曲线的线性回归方程为y=3 269x-29 207，斜率b和截距a分别23 269和-29 207，相关系数R2=0.999 8。

标准曲线引入的标准不确定度由下式求得:

则EDTA-2Na标准曲线拟合引入的相对不确定度：

2.2.7 计算合成不确定度和扩展不确定度

2.2.8 测量不确定度报告

因此，依据本文所建立的方法，所测定的八宝粥罐头样品中EDTA-2Na的含量检测结果为：(162.600±3.578)mg/L。

2.2.9 不确定度的分析

将各不确定度分量值按比例绘成图1，可以看出，标准溶液配制引入的不确定度最大，其次是样品处理过程中回收率引入的不确定度和最小二乘法拟合标准曲线求样品质量浓度所引入的不确定度。由于样品称量引入的不确定度极小，因此可忽略不计。

图1 测量不确定度分量分布示意图

3 结论

采用本文建立的方法，当取样量为2 g时，k=2(95%置信度)，所测定的八宝粥罐头中EDTA-2Na的含量检测结果为：(162.600±3.578) mg/L。

测定过程中不确定度分析表明，标准溶液配制过程引入的不确定度最大，其次是样品处理过程中回收率引入的不确定度和最小二乘法拟合标准曲线求样品质量浓度所引入的不确定度。因此，在检测过程中要按规范配制标准溶液，尽可能保证标准溶液配制的准确性和实验结果的稳定性，尽可能的减少测量结果误差，来降低不确定度。本研究对八宝粥罐头食品中EDTA-2Na检测不确定度进行评定，为HPLC法测定食品中EDTA-2Na含量的质量控制提供了理论依据。

[1] 黄 建, 李文仙, 霍军生.反相离子对高效液相色谱法测定果味饮料中的乙二胺四乙酸二钠[J]. 中国食品工业,2009(6):55-56.

[2] GB 2760—2014,食品安全国家标准食品添加剂使用标准[S].

[3] 林 琳, 孙存玉, 张雪婧, 等.乙二胺四乙酸二钠、山梨酸及桂皮提取物对肠出血性大肠杆菌O157:H7的协同效果[J]. 中国食品添加剂,2014(3):73-76.

[4] Kemmei T, Kodama S, Yamamoto A, et al. Determination of ethylenediaminetetraacetic acid in foods by reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. Food Chemistry, 2013,138(2):866-869.

[5] Retho C, Diep L. Low-level determination of ethylenediaminetetraacetic acid in complex matrices[J]. Zeitschrift fürLebensmittel-Untersuchung und-Forschung, 1989,188(3):223-226.

[6] Krokidis A A, Megoulas N C, Koupparis M A. EDTA determination in pharmaceutical formulations and canned foods based on ion chromatography with suppressed conductimetric detection[J]. Analytica Chimica Acta, 2005, 535(1): 57-63.

[7] Hamano T, Mitsuhashi Y, Kojima N, et al. Sensitive spectrophotometric method for the determination of ethylenediaminetetraacetic acid in foods[J]. Analyst, 1993, 118(7): 909-912.

[8] Laamanen P L, Mali A, Matilainen R. Simultaneous determination of DTPA, EDTA, and NTA by capillary electrophoresis after complexation with copper[J]. Analytical and bioanalytical chemistry, 2005, 381(6): 1264-1271.

[9] Quintana J B, Reemtsma T. Rapid and sensitive determination of ethylenediaminetetraacetic acid and diethylenetriaminepentaacetic acid in water samples by ion-pair reversed-phase liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1145(1): 110-117.

[10] 魏冬旭, 韩广源, 孙 莹, 等. 高效液相色谱-串联质谱法测定食品中的乙二胺四乙酸二钠[J]. 理化检验:化学分册, 2014(6): 698-701.

[11] 邓道庭, 梅 勇, 吴宇伉, 等.顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法测定血清中甲基叔丁基醚的不确定度[J]. 中国卫生检验杂志,2016(6):906-908.

[12] JJG 196—2006,常用玻璃量具检定规程[S].

[13] 江 星, 王永军, 唐 莹, 等.气相色谱内标法测定芝麻香型白酒乙酸乙酯不确定度评定[J]. 酿酒科技,2016(7):119-121.

[14] 汪 辉, 曹小彦, 彭新凯, 等.高效液相色谱法测定小麦粉与大米粉中甲醛次硫酸氢钠含量的不确定度评定[J]. 食品科学,2009(12):205-208.

Uncertainty evaluation for the determination of ethylenediamine tetraacetic acid disodium saltin in canned eight-ingredient porridge by HPLC

Liu Silei, Zhao Yun, Dai Xuanli, Wu Ping

Hangzhou Wahaha Group Company Limited (Hangzhou 310018)

Based on JJF1059.1—2012 “EvaluationandExpressionofUncertaintyinMeasurement”, a mathematical model was established to assess the uncertainty of analyzing ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt (EDTA-2Na) in canned eight-ingredient porridge by high performance liquid chromatography (HPLC). Factors contributing to the uncertainty were analyzed, quantified and synthesized. The expanded uncertainty of EDTA-2Na determination for 2.0 g of samples was 3.578 mg/L. The results show that the uncertainty of measurement is mainly caused by the preparation of standard solution, recovery of sample during processing and the establishment of the standard curve. The evaluation method is reasonable, clear, simple, accurate, and references for the reliability and consistency of the laboratory testing data．

ethylenediamine tetraacetic acid disodium (EDTA-2Na); uncertainty; high performance liquid chromatography (HPLC); canned eight-ingredient porridge

2017-02-09

刘四磊，男，1987年出生，硕士研究生，工程师，研究方向为食品质量检测与安全控制。

TS297

A

1672-5026(2017)03-065-06