四种脱钙液对骨组织HE和免疫组化染色的影响

李 锐，金玉兰，韩一丁，刘红刚

四种脱钙液对骨组织HE和免疫组化染色的影响

李 锐，金玉兰，韩一丁，刘红刚

脱钙液；组织脱钙；HE染色；免疫组织化学染色

骨是由黏多糖和蛋白纤维构成的有机质及沉积于其中的无机盐组成，无机盐主要是羟基磷灰石结晶，其中大部分为磷酸钙和碳酸钙；由于骨的特殊构成，使骨组织质地较硬，较难制成切片影响诊断工作，因此制片过程中必须对其脱钙。目前临床工作中较常见的脱钙液是复合酸类脱钙液，是将2种或2种以上酸类脱钙液联合使用，或在单纯酸内加入另一种脱钙液或少量的其他试剂配制而成，能使骨组织中难溶于水的羟基磷灰石快速转化为易溶于水的酸式磷酸盐、氯化钙等，从而使标本软化。本文参考文献报道[1-4]配置4种不同成分的脱钙液，通过对舌骨及股骨头组织进行脱钙，比较4种脱钙液的优缺点，为今后的病理技术工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取2015年5月～2016年5月我院手术室送检全喉切除标本30例、股骨头组织20例。

1.2 脱钙液配制 A液：浓盐酸20 mL加入50 mL的10%中性福尔马林中，再加入30 mL自来水，制成20%盐酸甲醛液；B液：取A液100 mL加入10 g氯化钠，制成20%氯化钠盐酸甲醛液。C液：30 mL盐酸加入70 mL的10%中性福尔马林，制成30%盐酸甲醛液；D液：取C液100 mL加入2 mL冰醋酸制成醋盐酸甲醛液。

1.3 实验所用仪器及试剂 日本Tissue-Tek VIP全自动脱水机；德国Leica EG1150H石蜡包埋机、Leica2245轮转式石蜡切片机；日本Tissue-Tek Prisma全自动染色机、Tissue-Tek Film全自动胶片封片机。10%中性福尔马林及染色的脱蜡液、透明液、乙醇、伊红、Harris苏木精试剂，均购自九州柏林公司；浓盐酸购自北京化工厂。免疫组化采用EnVision法染色；一抗CD61、CD68、CD235a、Ki-67，均购自福州迈新公司；二抗EnVision试剂盒，购自北京中杉金桥公司。

1.4 方法

1.4.1 脱钙方法 新鲜组织及时用10%中性福尔马林固定24 h，每例舌骨分别取8～12块，股骨头每例取16～20块，分别制成大小0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm～1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm标本，并做好标记。上述所有骨组织分别分成4份，并确定每份所含骨组织与另外3份成分基本相同，分别放入A、B、C、D四种脱钙液中，在室温下进行脱钙，每24 h更换脱钙液。

1.4.2 脱钙终点判定及脱钙后处理 每间隔1 h观察1次，标本以手感有弹性、大头针能轻松刺入为脱钙完成，所有标本脱钙后均放入自来水中冲洗30 min，再放入脱水机中脱水处理，第2天石蜡包埋，切片4～6 μm厚，70 ℃烤箱烤片30 min，行常规HE染色，全自动封片机封固。

1.4.3 免疫组化染色 选取4例舌骨组织70 ℃拷片40 min，脱蜡后放入3%H2O2封闭10 min，pH 6.0的柠檬酸抗原修复液高压锅修复2.5 min，滴加一抗，37 ℃孵育60 min，经免疫组化EnVision法染色，37 ℃孵育15 min，DAB显色，核复染、脱水、透明、封固。

2 结果

2.1 脱钙时间 不同组织采用不同的脱钙时间，对于舌骨组织D液(醋盐酸甲醛液)用时最短，其余脱钙液时间：A液(20%盐酸甲醛液)>B液(20%氯化钠盐酸甲醛液)>C液(30%盐酸甲醛液)。股骨头的松质骨在C液和D液中用时较短，而在A液中用时较长；密质骨在A液和B液中用时最长，而在D液中用时最短(表1)。

表1 不同骨组织脱钙时间

2.2 组织的酸化程度 组织经B液脱钙后大体变化不明显，经另外3种脱钙液处理后短期变化不明显，但时间超过24 h后组织会轻微发黄，时间越长发黄现象越严重。

2.3 切片质量 经4种脱钙液脱钙后所有骨组织基本均能完整切片，但经A液和B液处理后的组织，切片过程中部分会有沙粒感，尤其是股骨头密质骨在切片时感觉较硬，切片刀磨损严重，肉眼和镜下均能看见比较明显的刀痕；经C液和D液脱钙后的组织能完整制片，且经D液脱钙后的组织，切片时组织相对较软，更易切片。

2.4 HE染色效果 经A液和B液脱钙后股骨头密致骨切片不平整，镜下刀痕明显，厚薄不均现象常见，且经A液处理后核染色发红现象明显，部分核结构不清，但是经B液处理后HE染色核呈紫蓝色、染色质结构清晰，核质对比鲜明；经C液和D液脱钙后的组织镜下骨组织较平整，骨板结构清晰(图1)，C液处理后的组织高倍镜下可见部分核红染、核结构模糊，核质对比不清晰；经D液处理后的组织核呈紫蓝色、发红现象较少见，核仁结构清晰，核质对比明显(图2)。

2.5 免疫组化染色效果 经4种脱钙液处理后，CD68、CD61、CD235a、Ki-67在骨髓中的表达：CD68、CD235a表达差异不大；CD61在A液、B液和D液中表达均较好，呈棕黄色细胞质阳性(图3)，而在C液中表达较模糊，染色较淡，甚至呈阴性。Ki-67在B液和D液中呈较强的核阳性(图4)，在A液和C液液中均呈局灶阳性。

①②③④

图1 经C液脱钙的股骨组织：可见骨组织平整，骨板结构清晰 图2 经D液脱钙的股骨组织：核蓝染，核质对比明显，核仁清晰 图3 经B液脱钙的舌骨骨髓组织：CD61呈阳性，EnVision法 图4 经D液脱钙的舌骨骨髓组织：Ki-67呈阳性，EnVision法

3 讨论

脱钙是应用化学或物理的方法将骨组织中的钙盐与胶原纤维分离，去除其中较硬的钙盐成分，保留完整的胶原纤维。目前需要寻找一种既能有效、快速去除骨组织中的钙盐成分，又能很好的保护骨组织细胞结构的脱钙液。

浓盐酸是一种强酸，为无机酸，具有极强的挥发性，与骨组织中钙盐结合后可加速脱钙，对组织收缩小，脱钙均匀完整，能较好保存骨及骨髓组织中的组织和细胞结构，是骨及骨髓组织的理想脱钙液[5]；且低浓度盐酸能较好的保持骨组织和骨髓组织的抗原性[6]，是骨及钙化组织进行免疫组化染色良好的脱钙液。10%中性福尔马林是日常工作中尤其是免疫组化常用的固定液，对组织渗透力强、收缩小，能使大多数抗原物质保存较好，由于中性福尔马林中加入磷酸缓冲液，不易被氧化，故对组织标本的固定(特别是长期固定)、 染色效果非常有利[7]。不同浓度的盐酸甲醛液在对骨组织脱钙的同时又能起固定作用，从而减少组织的固定及前期处理时间。因此，本实验结合以往的工作经验选择2种不同浓度的盐酸甲醛液作为基础液，再参照以前的研究成果[8-9]，分别加入氯化钠和冰醋酸，分析几种脱钙液的脱钙效果。

通过对50例骨组织的脱钙分析，本实验发现4种脱钙液基本都能完全脱钙，其中A液和B液脱钙速度较慢，D液脱钙速度较C液快，且经D液处理后的组织切片较平整，核染色较清晰，核质对比明显，免疫组化染色相对较稳定，可能与醋酸的加入有关。醋酸本身也是一种固定液，其穿透力强，可促进脱钙液和甲醛固定液在组织内的渗透速度，加速脱钙[10]，同时醋酸具有使组织尤其是胶原纤维和纤维蛋白膨胀的作用，但通过其他溶液的稀释，其副作用会明显降低，并且可抵消盐酸、甲醛的收缩作用，维持组织细胞的正常结构和形态[11]。除此之外，醋酸对染色体具有固定作用，能较好地保存染色体结构，减少酸对细胞核的破坏。

本实验中C液和D液的脱钙时间相差不大，但都比A液快，提示较高浓度的盐酸甲醛液能加快骨组织的钙溶解，提高脱钙速度。Yamamoto-Fukud等[12]也认为酸类浓度越高、脱钙时间越短，但是曹颖[9]发现不同酸浓度的脱钙液其脱钙时间和效果相差不大，这可能与选择较低浓度盐酸且浓度之间的差异不大有关(5%～8.5%)。另外，本实验还发现经B液脱钙后脱钙液颜色改变不明显，组织块颜色不发黄，HE染色切片透亮，核呈紫蓝色、细微结构清晰，核质对比明显，且脱钙速度和效果以及免疫组化染色均较A液效果好，说明氯化钠在加快脱钙速度的同时又能降低酸对组织的破坏，保护细胞抗原，这可能是由于氯化钠降低溶液中离子的活度，导致骨组织中无机盐(羟基磷灰石)的溶解度增加、胶原的酸解程度降低，保证脱钙骨组织的结构完整性[9]。脱钙后脱钙液颜色变黄，组织块颜色变浅黄，提示组织酸化将影响HE及免疫组化染色[13]，这在本实验中也得到证实。因此，对于较大的骨组织脱钙前应将其锯成薄片的小块组织，利于脱钙液的渗透，加快脱钙速度，减少组织的酸化。

本组中经A液和C液处理后的组织，虽然均能完整切片，但部分组织核染色发红现象明显，有时会出现核模糊、核仁结构不清的现象，免疫组化染色不稳定，不利于诊断。另外A液染色所用时间较长，特别是对于密质骨，所需时间更长，而且长时间脱钙后组织酸化较严重，核质对比差，染色质结构欠清晰，因此对于质地较硬的密质骨其应用受到限制。本实验发现高浓度的盐酸脱钙速度较快，HE切片效果较佳，尤其是醋盐酸甲醛液，其配方简单，所需试剂在日常工作中较易获得，是一种较为理想的脱钙液，但是高浓度的酸会破坏组织及细胞的抗原性，在今后的实际工作中应加以注意，使用高浓度的酸进行脱钙的标本，应考虑到免疫组化染色假阴性的可能。

20%氯化钠盐酸甲醛液对组织的损伤小，HE染色效果好，组织切片透亮，核结构清晰，免疫组化染色较稳定，虽然对于较硬的组织其脱钙耗时相对较长，但对于较疏松的骨组织及含大量造血细胞的骨髓穿刺标本仍然是一种较好的选择。

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首都医科大学附属北京同仁医院病理科，北京 100730

李 锐，女，硕士，技师。Tel:(010)58268683, E-mail：151675007@qq.com 刘红刚，男，教授，博士生导师，主任医师，通讯作者。Tel:(010)58268685，E-mail： liuhg1125@163.com

时间：2017-5-17 23:54 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.028.html

R 446

B

1001-7399(2017)05-0579-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.028

接受日期：2017-02-24