套细胞淋巴瘤中IgH/CCND1融合基因及细胞周期相关蛋白的表达

陈顺平，吴文乔，沈洪武，邹宗楷，苏海燕，纪思灵，洪少君

套细胞淋巴瘤中IgH/CCND1融合基因及细胞周期相关蛋白的表达

陈顺平，吴文乔，沈洪武，邹宗楷，苏海燕，纪思灵，洪少君

目的 探讨细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4、p16蛋白及IgH/CCND1融合基因在套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL)中的表达及相互关系。方法 采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)法及免疫组化EnVision两步法联合检测40例已利用基因重排技术及免疫组化确诊的MCL石蜡包埋组织(实验组)及20例淋巴结反应性增生的石蜡包埋组织(对照组)，并利用对照组建立MCL的IgH/CCND1融合基因阈值。结果 实验组中Cyclin D1蛋白阳性率为100%，CDK4蛋白阳性率为87.50%，p16蛋白阳性率为17.50%；实验组中IgH/CCND1 融合基因的阳性率为100%；对照组中IgH/CCND1 融合基因均阴性。结论 MCL细胞周期调控中Cyclin D1-CDK4-p16通路关系符合肿瘤细胞周期调控原理的阐述；采用FISH技术建立检测IgH/CCND1融合基因阈值，为国内该融合基因的FISH法判断提供依据。

套细胞淋巴瘤；CCND1；融合基因；荧光原位杂交

肿瘤的细胞周期调控异常与细胞癌变密切相关，细胞周期调控机制及在p16-Cyclin D1-CDK4-RB通路之间的关系，一直是近年细胞周期调控研究的热点。细胞周期中Cyclin D1能结合并活化CDK4形成复合物，该复合物能使RB磷酸化并失活，从而调节细胞周期从G1期过渡到S期，促进肿瘤细胞分裂、增殖。p16主要与负向调节细胞周期因子Cyclin D1竞争，并与CDK4结合形成复合物，抑制CDK4的活性，可使低磷酸化或非磷酸化RB积聚，从而抑制细胞增殖。套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL)是一种具有独特临床病理特征的B细胞非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)[1]，且Cyclin D1是MCL具有遗传学异常的特征之一。因此，Cyclin D1、CDK4及p16等关键点关系的分析对MCL细胞周期调控机制的整体研究具有重要意义。目前，联合检测Cyclin D1、CDK4与p16在MCL中的表达尚未见报道。MCL多通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、PCR或者Southern Blotting等方法检测t(11；14)(q13；q32)易位情况，国内外试剂公司建议血液肿瘤的FISH检测阈值均以15%作为参考。本实验利用FISH法及免疫组化EnVision两步法对明确诊断MCL和淋巴反应增生石蜡包埋组织进行检测，旨在国内首次建立t(11 ;14)染色体易位产生IgH/CCND1融合基因的阈值，为国内该融合基因的FISH法判断提供依据，以及探讨MCL中Cyclin D1、CDK4及p16的表达及相互关系。

1 材料与方法

1.1 材料 收集漳州市医院2011～2015年明确诊断的40例MCL(实验组)，其中男性25例，女性15例；年龄45～82岁，中位年龄63.5岁。另选淋巴结反应性增生20例作为对照(对照组)；所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋。

1.2 主要试剂与仪器 探针GLP IgH/CCND1双色双融合基因探针由北京金菩嘉公司提供；兔抗CCND1单克隆抗体(即用型)购于福州迈新公司；兔抗CDK4单克隆抗体(即用型)购于北京中杉金桥公司；鼠抗p16INK4a单克隆抗体(即用型)购于福州迈新公司；ABI3130测序仪，Olympus BX51型荧光显微镜，Dake原位杂交仪，胃蛋白酶(Sigma产品)。

1.3 免疫组化 免疫组化染色采用EnVision两步法，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.4 FISH检测 (1)将3 μm厚组织涂胶切片浸于二甲苯中脱蜡至水；(2)100 ℃用ETDA处理组织切片20 min；(3)室温下用2×SSC×3 min×2次漂洗；(4)组织滴上配制即用型胃蛋白酶，于37 ℃预热的孵育盒中消化4～8 min；(5)室温下用2×SSC×3 min×2次漂洗，梯度乙醇脱水固定，自然干燥；(6)避光环境中，探针混合液滴于杂交区域，于83 ℃的自动杂交仪中变性5 min后置于37 ℃过夜杂交；(7)第2日移去盖玻片，于46 ℃将玻片置于2×SSC×10 min×2次漂洗，置于2×SSC/0.1% NP-40溶液中5 min。玻片干燥后加DAPI复染液，放入暗盒中复染数分钟后，用Olympus BX51荧光显微镜在DAPI/FIFC/RHOD三色滤光镜激发下观察间期细胞荧光杂交信号。

1.5 结果判断 (1)免疫组化判断：Cyclin D1阳性着色定位于细胞核，CDK4阳性着色定位于细胞核和细胞质，p16阳性着色定位于细胞核和细胞质。根据染色结果≤5%为0分，6%～25%阳性细胞为1分，26%～50%阳性细胞为2分，>50%阳性细胞为3分；根据染色强度无色为0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。将每张切片着色细胞百分率得分与着色程度得分相乘，同一视野如有染色强度不一，取其平均值作最后得分，其中0～3分为阴性(-)；>3分为阳性(+)。(2)FISH结果判断：IgH/CCND1双色双融合基因每例分析200个细胞，单个间期细胞核中红色及绿色信号数各2个为正常；其中红色信号代表CCND1基因，绿色信号代表IgH基因，黄色信号为IgH/CCND1融合基因。间期细胞核内≥1个黄色信号，为存在IgH/CCND1融合基因。根据阈值=平均数(M)+3个标准差(SD)建立20例正常标本阈值：异常细胞<26个为正常，≥26个为存在IgH/CCND1单融合基因。

1.6 统计学分析 应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阈值建立 本实验采用FISH技术检测对照组，根据阈值=平均数(M)+3个标准差(SD)建立20例正常标本阈值，IgH/CCND1单融合基因信号阈值为≥13%；对照组未存在IgH/CCND1双融合基因信号。

2.2 IgH/CCND1融合基因比例及表现形式 实验组40例石蜡包埋MCL组织均通过基因重排(IgH3+IgK)检测技术验证(图1)；FISH检测40例实验组IgH/CCND1融合基因，阳性率达100%(图2)，均存在MCL的t(11；14)(q13；q32)易位，20例对照组只存在个别黄色信号或未见黄色信号，且阳性率未达到阈值标准(图3)；实验组各标本中具有融合信号的细胞比例为19%～96%，大部分病例以单融合基因信号为主，阳性率为14%～60%，小部分以双融合基因信号为主，阳性率6%～86%，且所有实验组的标本均有这两种融合基因信号共同存在。

图1 IgH TubeB在269.79及316同时出现2个蓝色的单克隆峰，PCR毛细管电泳法

2.3 MCL中相关蛋白表达 实验组石蜡包埋组织40例采用免疫组化EnVision两步法联合检测Cyclin D1、CDK4、p16蛋白的表达，结果显示Cyclin D1蛋白阳性率为100%(图4)、CDK4蛋白阳性率为87.50%(图5)、p16蛋白为17.50%(图6)。

2.4 Cyclin D1与CDK4、p16蛋白表达的相关性 实验组免疫组化结果显示：40例MCL中Cyclin D1与CDK4蛋白表达一致性高；与p16蛋白表达一致性低。

3 讨论

淋巴瘤的分型诊断及发病机制一直是人们不断研究探索的热点，该类肿瘤还具有其独特的分子遗传学及免疫表型特点，CCND1基因重排和(或)高表达是MCL的特征，是与其他淋巴瘤鉴别的重要指标，也是MCL细胞周期调控异常关键性因素，而有关MCL细胞周期的调控机制研究，也一直是近年细胞周期调控分析的焦点。在促有丝分裂信号的刺激下，Cyclin D1能结合并活化CDK4形成复合物，Cyclin D1、CDK4是重要的细胞周期蛋白调控基因[2-3]，控制真核细胞从G1期进入DNA合成期S期是关键检测点。在细胞周期调控p16-Cyclin D1-CDK4-RB通路中，若基因异常表达将引起细胞周期调节失控，细胞过度增殖，导致肿瘤的发生、发展[4]。p16则是细胞周期调控p16-Cyclin D1-CDK4-RB通路中负向调节因子，其与Cyclin D1竞争性的同CDK4结合，使细胞增殖过程受到抑制。当p16不能正常表达，失去竞争结合CDK4的能力时，增生的细胞失去控制向癌变发展。所以，阐明G1/S期限制点的Cyclin D1-CDK4-p16通路对细胞周期有至关重要的作用[5]。目前文献报道MCL多通过检测t(11；14)(q13；q32)易位产生的IgH/CCND1融合基因，而对于t(11；14)(q13；q32) 易位及Cyclin D1、CDK4与p16等蛋白表达系统性分析尚未见报道，MCL的报道多集中在胆管癌、骨肉瘤、前列腺癌等[6-8]。

②③④⑤⑥图2 绿色信号的IgH基因与红色信号的CCND1基因叠加合成黄色信号的IgH/CCND1融合基因，FISH法 图3 淋巴结反应性增生组织中FISH结果显示绿色信号的IgH基因与红色信号的CCND1基因未见叠加合成黄色融合基因信号，FISH法 图4 MCL组织中CyclinD1蛋白呈阳性，EnVision两步法

图5 MCL组织中CDK4蛋白呈阳性，EnVision两步法 图6 MCL组织中p16蛋白呈阳性，EnVision两步法

MCL最具特征的遗传学异常是t(11；14)(q13；q32)易位，70%～95%的MCL患者具有t(11；14)(q13；q32)染色体易位产生的IgH/CCND1融合基因，且主要通过FISH检测IgH/CCND1融合基因的存在，PCR法检测敏感性较低，且较容易污染。对于MCL t(11；14)(q13；q32)易位的检测，特别是针对石蜡包埋完整组织行FISH检测t(11；14)(q13；q32)易位，国内外未见大规模报道，且针对如细针组织或微阵列组织等[9]报道检测肿瘤细胞数较为有限，特别是应用FISH技术检测，所得结果未能准确反应整体组织情况，大多数文献对t(11；14)(q13；q32)产生IgH/CCND1融合基因未建立阈值，特别是国内未见建立其阈值，诊断缺少客观参考标准。本文通过双色双融合探针采用FISH技术检测20例淋巴反应性增生组织，FISH检测融合基因信号均为单融合基因，未见双融合基因存在，根据阈值=平均数(M)+3个标准差(SD)，首次建立了国内有关IgH/CCND1单融合基因阈值(13%)。通过建立的阈值对实验组的40例MCL组织进行IgH/CCND1融合基因行FISH检测，结果显示所有标本均存在t(11；14)(q13；q32)易位，各标本融合基因检测中，大部分病例以单融合基因为主，小部分以双融合基因为主，且实验组的标本均有2种融合基因共同存在。本实验的对照组标本未见有双融合基因存在，与试剂说明书提供的判断标准较为不同，其认为异常细胞可见2个融合基因信号，建立双融合基因阈值，而实际检测中异常细胞可同时存在单融合基因信号和双融合基因信号。目前试剂厂家建议血液肿瘤的FISH检测阈值不管单融合和双融合基因信号一般以15%作为参考，但在实验组标本检测中大部分以单融合基因信号为主，而对照组未见双融合基因信号存在，只能建立单融合基因阈值。本组利用对照组分别对样本中200个细胞进行单融合信号和双融合信号的计数，所得阈值为单融合信号≥13%，但在对照组中未见有双融合信号存在，一般可认为存在双融合基因信号或单融合信号≥13%或两者皆有则可以认为样本为FISH融合基因阳性。因此，本组建立的阈值来判断实验组的融合基因存在的结果与国内外文献报道一致[9-11]；比熊小亮等[12]采用半巢式PCR 法检测t(11；14)易位的阳性率高。当MCL中肿瘤细胞极少的情况下进行该融合基因FISH检测，我们认为双融合信号比单融合信号更具有特异性，因为只存在于实验组。因此，在MCL初次诊断时，对样本双融合FISH信号数量的检测具有重要意义，应加以甄别。在FISH实际融合基因信号判断中应特别注意，信号计数应考虑双方基因位点空间位置不同引起假阳性结果，融合基因信号存在认定应保证红色与绿色信号点重叠成黄色信号，红色与绿色距离相差小于1个信号点且未形成黄色信号不可认定为融合基因信号存在。

本实验采用免疫组化EnVision两步法联合检测对照组及实验组中Cyclin D1、CDK4、p16蛋白的表达，以验证3种蛋白在MCL的表达及相互关系。结果显示实验组中Cyclin D1蛋白阳性率为100%、CDK4蛋白阳性率为87.50%，p16蛋白仅有部分表达，阳性率为17.50%；提示CDK4蛋白在Cyclin D1阳性的MCL中阳性率高，但p16蛋白大部分病例不表达，阳性率低；3种蛋白的表达结果显示MCL细胞周期调控机制中p16在细胞增殖癌变过程中可能受到抑制，失去竞争结合CDK4的能力，使Cyclin D1及CDK4高表达。结果验证了MCL细胞周期调控中Cyclin D1-CDK4-p16通路中上下关系，与其他肿瘤关于Cyclin D1-CDK4-p16关系的报道相似，但阳性率比其他肿瘤高。

综上所述，IgH/CCND1融合基因是MCL遗传学异常的特征之一，Cyclin D1、CDK4蛋白的高表达及p16蛋白低表达是MCL细胞周期调控的特征。

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Expression of IgH/CCND1 fusion gene andcell cycle associated protein in mantle cell lymphoma

CHEN Shun-ping, WU Wen-qiao, SHEN Hong-wu, ZOU Zong-kai, SU Hai-yan, JI Si-ling, HONG Shao-jun

(DepartmentofPathology,ZhangzhouHospitalAffiliatedtoFujianMedicalUniversity,Zhangzhou363000,China)

Purpose To investigate the expression of cell cycle related protein including Cyclin D1, CDK4, p16 and IgH/CCND1 fusion gene in mantle cell lymphoma (MCL) and their relationship with each other. Methods The expression of cell cycle related protein including Cyclin D1, CDK4, p16 and IgH/CCND1 fusion gene were detected on the 40 cases of MCL (expreimental group) and 20 cases of reactive hyperplasia (control group) by using the combined detection of fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunohistochemistry of EnVision two methods. 40 cases of MCL were confirmend by using gene rearrangement technique and immunohistochemistry. The threshold of IgH/CCND1 fusion gene of MCL was established in the control group. Results In the experimental group, Cyclin D1 protein positive expression rate was 100%, the positive expression of CDK4 protein rate was 87.50%, p16 protein positive expression rate was 17.50%. Positive rate of IgH/CCND1 fusion gene of 100%. These cell cycle related protein and IgH/CCND1 fusion gene were negative in the control group. Conclusion In MCL, Cyclin D1-CDK4-p16 pathway is consistent with the principle of tumor cell cycle regulation. The establishment of threshold value of IgH/CCND1 fusion gene by FISH technique may provide the basis for the judgement of FISH of the IgH/CCND1 in China.

mantle cell lymphoma；CCND1； fusion gene； fluorescence in situ hybridization

福建省卫生计生委青年科研课题(2014-2-45)

福建医科大学附属漳州市医院病理科 363000

陈顺平，男，主管技师。E-mail: 471231682@qq.com 苏海燕，女，硕士，副主任医师，通讯作者。E-mail：sujin000064@163.com

时间：2017-5-17 23:53 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.009.html

R 733

A

1001-7399(2017)05-0511-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.009

接受日期：2017-02-16