睾丸原发性弥漫大B细胞淋巴瘤中EZH2蛋白的表达及其意义

马世荣，王映梅，刘 杨，郭双平

睾丸原发性弥漫大B细胞淋巴瘤中EZH2蛋白的表达及其意义

马世荣1,2，王映梅1,2，刘 杨2，郭双平1,2

目的 探讨睾丸原发性弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)中EZH2蛋白的表达、临床病理特征及意义。方法 采用免疫组化Ventana Ultra View两步法检测17例睾丸原发性DLBCL中EZH2蛋白的表达，并结合文献分析其病理形态、诊断及鉴别诊断。采用Sanger法检测EZH2 641位点酪氨酸(Y641)突变。结果 11例肿瘤细胞类似中心母细胞，3例肿瘤细胞类似免疫母细胞，3例肿瘤细胞具有间变亚型特点。免疫组化标记显示14例为非生发中心B细胞样(non germinal centre B cell like, non-GCB)型，3例为生发中心B细胞样(germinal centre B cell like, GCB)型；其中15例肿瘤细胞核强阳性表达EZH2蛋白，2例约70%肿瘤细胞核中等强度表达EZH2蛋白；未检测到EZH2 Y641点突变。随访9例患者，中位生存时间35个月，EZH2蛋白的表达与患者预后无相关性。结论 睾丸原发性DLBCL属于少见的非霍奇金淋巴瘤，具有独特的临床病理学特征，绝大部分为non-GCB型；EZH2蛋白在睾丸原发性DLBCL过表达，其有望成为肿瘤诊断及治疗的新靶点。

睾丸原发性弥漫大B细胞淋巴瘤；EZH2；临床病理学特征；免疫表型；预后

原发性睾丸淋巴瘤(primary testicular lymphoma, PTL)属于少见的高度侵袭性结外非霍奇金淋巴瘤，占非霍奇金淋巴瘤的1%～2%，好发于60岁以上的老年男性[1-2]，其中原发性睾丸弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)占80%～90%。该病例少见，诊断较为困难。近年有研究发现组蛋白甲基转移酶——EZH2蛋白在多种恶性肿瘤包括淋巴瘤中异常表达，有望成为肿瘤诊断及治疗的新靶点[3-4]。本文回顾性分析17例原发于睾丸的DLBCL相关资料，探讨其临床病理学特征及EZH2蛋白表达的意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2002年1月～2014年3月第四军医大学西京医院住院治疗并有完整临床资料的17例原发于睾丸的DLBCL患者(表1)；所有病例均在第四军医大学西京医院病理科经病理组织学和免疫组化染色明确诊断。

1.2 方法 手术标本均经10%中性福尔马林固定，脱水、石蜡包埋、连续切片，行常规HE及免疫组化Ventana Ultra View两步法染色。所用抗体包括EZH2(USA)、CD20、CD3、CD21、CD10、BCL-6、MUM1、Ki-67(DAKO公司)，采用 Roche Benchmark XT全自动免疫组化染色仪进行染色。

1.3 结果判读 CD3、CD20、CD21、CD10以胞膜弥漫棕黄色颗粒为阳性；BCL-6、MUM1、Ki-67、EZH2以胞核内呈棕黄色颗粒为阳性；同时设立空白对照。其中CD10、BCL-6、MUM1的判读，需至少大于30%的肿瘤细胞表达抗体判断为阳性。

1.4 DNA提取、PCR及测序 制备5～10 μm厚的组织块，使用QIAGEN DNA FFPE试剂盒提取基因组DNA。应用正向引物：5′-GGCTGGGGGATTTTTATCAA-3′和反向引物：5′-GTTATCAGTGCCTTACCTCTCCA-3′，对包含EZH2 Y641位点编码基因的DNA进行PCR扩增。使用相同的引物序列对正向和反向的PCR产物进行测序。

2 结果

2.1 临床特点 本组17例原发睾丸DLBCL患者发病年龄26～86岁，平均58.8岁，>60岁者10例(占58.8%)。5 例(29.4%)为左侧睾丸受累，9例(52.9%)为右侧睾丸受累，3例(17.6%)为双侧睾丸受累(表1)。17例患者均未见睾丸外侵犯，首发症状均为患侧睾丸无痛性肿大。

2.2 病理检查 眼观：多数肿物界限清楚，少数肿物与周围组织界限不清。肿物直径1.5～8 cm，平均5.6 cm，切面灰白、灰黄色，实性、质硬。镜检：低倍镜下，正常睾丸结构被破坏，肿瘤性淋巴细胞弥漫浸润，其中1例发生大片坏死(图1)。高倍镜下，肿瘤细胞体积较大、中等量胞质，细胞核呈圆形，细胞之间缺乏黏附性。17例中有11例肿瘤细胞核内可见2～3个小核仁，类似于中心母细胞(图2)，有3例肿瘤细胞核内可见1个居于中央的大核仁，类似于免疫母细胞。有3例形态学上具有间变特点，细胞体积大，细胞核异型性及多形性更加明显，可见多核或巨核瘤细胞，病理性核分裂象多见(图3)。1例可见睾丸白膜侵犯，1例可见血管受累。

2.3 免疫表型分型 17例睾丸原发性DLBCL的肿瘤细胞均弥漫强阳性表达B细胞标志物CD20(图4)，根据Hans法对肿瘤进行分型，即根据肿瘤细胞表达CD10、BCL-6及MUM1的情况进行分型，分为生发中心B细胞样(germinal centre B cell like, GCB)型和非生发中心B细胞样(non-germinal centre B cell like, non-GCB)型。如果肿瘤细胞CD10呈阳性，或仅有BCL-6呈阳性，MUM1呈阴性，则为GCB型；如果肿瘤细胞MUM1呈阳性，CD10呈阴性、BCL-6呈阳性或阴性，则为non-GCB型。根据Hans法对本组17例进行分型，其中non-GCB型14例，GCB 型3例(表1)。肿瘤细胞Ki-67增殖指数为34%～95%(图5)。

表1 17例睾丸原发性DLBCL的临床病理特征

2.4 EZH2蛋白的表达及突变检测 本组均表达EZH2蛋白(图6)，其中15例肿瘤细胞核强阳性表达EZH2蛋白，2例约70%肿瘤细胞中等强度表达

①②③④⑤⑥

图1 肿瘤组织周边可见大片坏死 图2 肿瘤细胞体积较大，核圆形，细胞之间彼此缺乏黏附性，细胞核内可见2～3个小核仁，类似于中心母细胞 图3 肿瘤细胞体积大，细胞核异型性及多形性更加明显，可见多核或巨核瘤细胞，病理性核分裂象易见 图4 肿瘤细胞胞膜弥漫表达CD20，Ventana Ultra View两步法 图5 肿瘤细胞Ki-67增殖指数为34%～95%，Ventana Ultra View两步法 图6 肿瘤细胞胞核弥漫强表达EZH2，Ventana Ultra View两步法

EZH2蛋白。肿瘤周围残存曲细精管及正常淋巴细胞不表达EZH2蛋白。本组均行EZH2的Y641突变检测，未发现突变。

2.5 治疗及预后 17例患者均进行患侧睾丸切除，部分患者术后按CHOP或R-CHOP方案进行化疗。9例患者获得随访资料，随访时间5～48个月，其中3例患者存活，6例患者死亡，中位存活时间为35个月(表1)。

3 讨论

DLBCL是一组异质性肿瘤，淋巴结外DLBCL的发病机制、免疫表型、分子遗传学特点、治疗及预后可能与发生于淋巴结者不同，如中枢神经系统、皮肤、纵隔原发性DLBCL在WHO(2008)淋巴造血系统肿瘤分类中将其作为特殊类型[5]，同时睾丸原发性DLBCL预后差、具有特殊性，目前关于其临床病理学研究较少，特别是缺乏靶向治疗的靶点。因此，针对这一现象，本组检测17例睾丸原发DLBCL中EZH2蛋白的表达情况，首次发现EZH2蛋白在睾丸原发DLBCL中过表达，并探讨其与肿瘤临床病理特征的关系。

3.1 临床病理特点 PTL于1877年由Malassez[6]首次报道，占全部睾丸肿瘤的9%，非霍奇金淋巴瘤的1%～2%，发病率约为0.26/10万[7]。多发于老年患者，是60岁以上老人睾丸恶性肿瘤中最常见类型[8]，其中80%～90%的PTL为DLBCL，本组睾丸原发性DLBCL患者年龄26～86岁， 60岁以上患者占58.8%，与文献报道的好发年龄一致[9]。5例发生在左侧睾丸，9例发生在右侧睾丸，3例双侧睾丸受累，首发症状均为患侧睾丸无痛性肿大。

3.2 组织学特征 多数肿瘤与周围组织界限清楚，个别病例肿瘤浸润周围组织。肿瘤直径1.5～8 cm，切面呈灰白、灰黄色，实性、质地中等。形态学上，肿瘤细胞体积较大，核圆形，细胞之间彼此缺乏黏附性，弥漫性浸润睾丸组织。其中14例为中心母细胞型，3例为免疫母细胞型，3例具有散在分布的异型性和多形性显著的肿瘤细胞，细胞体积大，中等量胞质，核染色质粗、细胞核形态不规则、巨核或多核、核膜增厚、核仁明显、核染色质呈空泡状或粗颗粒状，具有间变形态为间变亚型。1例可见大片坏死。

3.3 EZH2蛋白表达与基因突变 本组肿瘤细胞均弥漫强阳性表达B细胞标志物CD20，根据Hans法对肿瘤进行分型，其中non-GCB型14例(82.3%)，GCB 型3例(17.7%)，与文献报道的睾丸原发DLBCL的Hans分型以non-GCB型为主相符合[10]。Ki-67增殖指数为34%～95%，Ki-67增殖指数与分型无关。

近年研究发现组蛋白甲基转移酶——EZH2蛋白的异常表达和Y641热点突变与多种恶性肿瘤包括淋巴瘤的发生、发展有着密切的关系[11-12]。有文献报道EZH2蛋白参与前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤、恶性胶质瘤、原发髓母细胞瘤、骨髓恶性肿瘤等肿瘤的发生、发展[13]。其中在淋巴造血系统肿瘤，如DLBCL、滤泡性淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增生性疾病等肿瘤中均有EZH2的突变或缺失。目前，EZH2的Y641突变已经成为淋巴瘤分析的生物学热点，突变可以增加编码蛋白的活性，导致H3K27me3水平增高，从而促进淋巴瘤细胞的增殖[14-15]。此外，EZH2蛋白还与肿瘤细胞对化疗药物的耐药性有关[16]，可能是新的肿瘤治疗靶点。

本实验采用免疫组化Ventana Ultra View两步法对EZH2蛋白进行染色，其中15例肿瘤细胞中EZH2蛋白呈强阳性，2例约70%肿瘤细胞EZH2蛋白呈中等阳性，而非肿瘤性淋巴细胞及残存曲细精管不表达EZH2蛋白。本组结果表明：与非肿瘤性反应性淋巴结比较，17例睾丸原发性DLBCL均有EZH2蛋白的过表达，且肿瘤组织表达EZH2蛋白水平与肿瘤细胞形态学、免疫表型无相关性。同时，17例组织标本均进行EZH2 Y641点突变检测，结果均未发现突变。据文献报道，在高度侵袭性的淋巴瘤如NK/T细胞淋巴瘤中，虽然有EZH2蛋白的过表达，但未改变细胞内H3K3甲基化水平，因此并未出现EZH2基因突变[17]。由此可以推断EZH2蛋白的过表达与是否具有EZH2基因突变无必然的联系。EZH2在肿瘤组织异常表达可能不依赖于是否有EZH2基因的突变。EZH2抑制剂有望成为DLBCL有效的靶向治疗药物[18-20]，且EZH2抑制剂可同时抑制EZH2突变型和野生型的DLBCL肿瘤细胞生长[19]。 因此，检测肿瘤组织中EZH2蛋白的表达水平可为EZH2的靶向治疗提供依据。

3.4 鉴别诊断 睾丸原发性DLBCL属于罕见睾丸肿瘤，其组织学表现与睾丸其他肿瘤有相似之处，且其临床表现也缺乏特异性，易与其他肿瘤混淆。因此要想明确诊断，必须将临床表现、组织学特点及免疫表型相结合。原发于睾丸的DLBCL需与以下疾病进行鉴别：(1)睾丸精原细胞瘤，发病年龄低，平均40岁，镜下肿瘤细胞大而一致，胞质透明，核仁明显，肿瘤周围可见淋巴细胞浸润，曲细精管结构常被破坏。免疫组化染色显示肿瘤细胞表达SALL4、CD117及PLAP，有助于鉴别诊断。(2)慢性睾丸炎，一般由化脓性炎转变而来，镜下细胞成分较为混杂，主要为淋巴细胞、浆细胞及中性粒细胞等多种炎细胞弥漫浸润，鉴别较为容易。(3)胚胎性癌，年轻患者多见，典型病变组织学可以出现乳头状或腺管样结构，较易诊断。当肿瘤弥漫生长，呈实体型时则需与淋巴瘤进行鉴别。免疫组化染色肿瘤细胞表达CK、SALL4及PLAP，有助于鉴别诊断。

3.5 治疗及预后 睾丸原发性DLBCL属于高度侵袭性的肿瘤，患者的治疗主要是行睾丸根治性切除，术后辅以化疗，化疗方案主要为CHOP或R-CHOP。本组患者均进行患侧睾丸根治性切除，9例患者获得随访资料，随访时间5～48个月。其中，7例术后进行CHOP或R-CHOP方案的化疗，2例未进行化疗。9例中6例患者死亡，3例患者存活。

总之，睾丸原发性DLBCL是一种少见的特殊类型淋巴瘤，具有高度侵袭性，诊断及鉴别诊断均具有一定困难。EZH2蛋白在睾丸原发性DLBCL中的表达，有望成为分子靶向治疗的依据。

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Expression and significance of EZH2 protein in primarytesticular diffuse large B cell lymphoma

MA Shi-rong1,2, WANG Ying-mei1,2, LIU Yang2, GUO Shuang-ping1,2

(1DepartmentofPathology,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;2DepartmentofPathology,XijingHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

Purpose To explore the expression and significance of histone methyltransferase EZH2, clinicopathological features in primary testicular diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). Methods Immunohistochemical of Ventana Ultra View two-step staining was used to detect expression of EZH2 in 17 cases of primary testicular DLBCL. The relationship between EZH2 expression and its clinicopathological features were analyzed. Sanger squencing was used to detect EZH2 Y641 mutation in these cases. Results Morphologically, the tumor cells resembled centroblasts in 11 cases, immunoblasts in 3 cases, and anaplastic variants in 3 cases. Immunophenotypically, 14 cases were non-germinal centre B cell like (non-GCB) type and 3 cases were germinal centre B cell like (GCB) subtype. EZH2 overexpressed in all 17 cases. EZH2 overexpressed in nearly tumor cells with uniformly strong intensity in 15 cases, and more than 70% tumor cells with moderate to strong intensity in 2 cases. The follow-up information was obtained in 9 patients, with a median survival time of 35 months. No association was found between the level of EZH2 expression and outcome of patients. No mutation of EZH2 Y641 was detected. Conclusion Primary testicular DLBCL is a rare aggressive B cell lymphoma with distinctive clinicopathological features. Detection of EZH2 expected to assist in the diagnosis and treatment of tumor.

primary testicular diffuse large B cell lymphoma；EZH2； clinicopathological feature； immunophenotype； prognosis

国家自然科学基金(81472597)

1第四军医大学病理学教研室，西安 7100322第四军医大学西京医院病理科，西安 710032

马世荣，女，讲师。Tel:(029)84773412，E-mail： mashirong_@163.com 郭双平，女，硕士生导师，副教授，通讯作者。Tel:(029)84773412，E-mail： guoshuangping@163.com

时间：2017-5-17 23:52 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.004.html

R 737.21

A

1001-7399(2017)05-0485-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.004

接受日期：2017-03-17