聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取松花粉中总黄酮的工艺研究

邵圣娟,卫静莉

(太原工业学院 化学与化工系,山西太原 030008)



聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取松花粉中总黄酮的工艺研究

邵圣娟,卫静莉

(太原工业学院 化学与化工系,山西太原 030008)

采用聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取纯化松花粉中的总黄酮,确定双水相体系组成为26% PEG400-20%(NH4)2SO4,以萃取率和分配系数为指标,考察pH、温度和NaCl添加量对双水相萃取分配行为的影响,并结合正交实验优化萃取工艺参数。确定最佳萃取工艺条件为NaCl添加量为2.0%、pH4、温度为40 ℃,在此条件下松花粉总黄酮萃取率达到98.93%,其中NaCl添加量对于萃取分配行为的影响最大。此方法操作简便,水环境温和,分相时间短、萃取率较高,是松花粉总黄酮等天然活性产物分离纯化的一种有效方法。

双水相体系,分配系数,萃取率,黄酮类化合物,松花粉

松花粉作为药食兼用的花粉品种,含有丰富的营养成分和生物活性物质,对于脑血管疾病、糖尿病、肝损伤、神经衰弱等方面具有一定的疗效,同时还具有提高人体免疫力、美容养颜、抗衰老等功效[1]。

研究表明每1 g松花粉含有17.6 mg黄酮类化合物[2],其主要成分为黄酮和黄酮醇类[3],使松花粉表现为明显的抗氧化、抗衰老、降血糖、保肝护肝等药理作用。

双水相萃取技术(Aqueous Two-phase Extraction,ATPE)利用物质在以聚合物水溶液和盐溶液组成的互不相溶的两水相间分配系数的不同而达到萃取效果[4]。以聚合物和无机盐溶液组成的双水相体系,具有萃取条件温和、成相稳定、时间短,选择性高、易于放大和操作简便等优点,特别适用于生物活性物质、天然产物的提纯和分离,如酶[5]、多糖[6]、色素[7]、多酚[8-9]、黄酮类[10-11]等。

本实验主要研究PEG400/(NH4)2SO4双水相体系对于松花粉总黄酮的萃取分配行为,考察双水相组成、pH、温度、NaCl添加量等因素对于松花粉总黄酮萃取率的影响,以期为松花粉总黄酮的分离纯化提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马尾松花粉PinusmassonianaLamb.(40目) 云南省药材市场;芦丁对照品(纯度>98%) 中国药品生物制品检定所;无水乙醇、PEG400、(NH4)2SO4、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3、NaCl、柠檬酸、磷酸氢二钠 天津市北辰方正试剂公司。

722s型可见分光光度计 上海棱光技术有限公司;WBFY-205型微波化学反应器 天津科诺仪器设备有限公司;TGL20-B离心机 上海安亭科学仪器厂;HH-1恒温水浴锅 金坛市双捷实验仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 松花粉总黄酮的粗提取 准确称取10 g松花粉粉末,按料液比1∶25(g/mL)加入体积分数80%乙醇溶液,450 W微波处理5 min,将提取液于5000 r/min条件下,离心处理10 min。将离心后的上清液进行旋转蒸发浓缩,浓缩液用60%乙醇定容至50 mL容量瓶中。浓缩液质量浓度记为C0,将浓缩液配制成不同的浓度,备用。

1.2.2 双水相相图绘制 采用浊点滴定法[12]绘制PEG400-(NH4)2SO4双水相体系相图。操作方法如下:称取2.0 g质量分数为40%的PEG400溶液于50 mL比色管中,逐滴加入40%(NH4)2SO4溶液,使体系出现浑浊,记录(NH4)2SO4的滴加量;再滴加去离子水至体系完全澄清,记录所加水的质量,重复上述两步直至体系不再发生浑浊;计算各个浊点时PEG400和(NH4)2SO4的质量浓度,绘制 PEG400-(NH4)2SO4双水相体系相图。

1.2.3 单因素分配实验 在50 mL离心管中加入松花粉总黄酮粗提液2 mL和一定量的(NH4)2SO4、PEG400溶液,调节适宜的pH,保证双水相体系总量为10 g,充分混匀后以2000 r/min离心处理5 min,精确读取上、下相体积,并分别移取1 mL上、下相溶液,测定两相中松花粉总黄酮含量,计算相应的分配系数K和萃取率Y。

式中:R为相比,Vt为上相体积,mL,Vb为下相体积,mL;Ct为上相黄酮的质量浓度(mg/mL),Cb为下相黄酮的质量浓度(mg/mL)。

1.2.4 正交实验 根据单因素实验结果,以分配系数K、萃取率Y为实验指标,设计NaCl添加量、pH、温度三因素三水平正交实验,对萃取工艺条件进行优化。

表1 L9(34)正交实验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 微波辅助双水相萃取 称取1 g松花粉粉末,按料液比1∶25 (g/mL)加入26% PEG400、20%(NH4)2SO4组成的双水相体系中,在微波条件下直接萃取松花粉中的总黄酮,计算总黄酮的得率,并与微波乙醇法进行比较。

2 结果与分析

2.1 松花粉总黄酮含量的测定

以芦丁为对照品,采用“NaNO2-Al(NO3)3-NaOH”[13]络合显色分光光度法测定,得出芦丁质量浓度C(mg/mL)与吸光度A之间的线性回归方程为:A=9.6036C+0.0093,R2=0.9992。

2.2 双水相相图

PEG400-(NH4)2SO4双水相相图如图1所示,由双水相相图可知,曲线下方为单相区,曲线上的点为成相临界点,上方则为两相区。在两相区,当(NH4)2SO4的质量分数为20%,可与之形成双水相体系的PEG400的质量分数需大于17%。此实验结果与相关文献[14]结果基本一致。当PEG400的质量分数为20%时,(NH4)2SO4的质量分数需大于18%才可与之可形成双水相体系。因此,应选取偏离临界点的适宜数值,才易于形成双水相体系。

图1 双水相相图Fig.1 PEG400/(NH4)2SO4 aqueous two-phase system phase diagram

2.3 双水相体系的组成

2.3.1 PEG400质量分数对双水相萃取效果的影响 测定结果如图2。

图2 PEG400质量分数对双水相萃取效果的影响Fig.2 Effect of mass fraction of PEG400 on partition ratio and extraction rate

随着PEG400 质量分数的增加,上相体积逐渐增加,下相体积逐渐减少,两相相比R逐渐增大,上相中总黄酮的浓度也逐渐增大,分配系数K和萃取率Y逐渐增大,与文献[14]结果一致。主要是由于随着上相PEG400质量分数的增加,上相水合能力增大,使得上相体积增加,而且利于黄酮在上相的富集,使得上相中总黄酮的浓度也提高,从而分配系数和萃取率都提高。当PEG400 质量分数为26%时,均达到最大值;当PEG400质量分数继续增大时,双水相体系黏度逐渐增大,阻碍了相际间的分子转移,不利于传质,导致分配系数下降,影响萃取率,与文献[15]结果基本一致。因此,选择PEG400的最佳质量分数为26%。

2.3.2 (NH4)2SO4质量分数对双水相萃取效果的影响 测定结果如图3。

图3 (NH4)2SO4质量分数对双水相萃取效果的影响Fig.3 Effect of mass fraction of(NH4)2SO4on partition ratio and extraction rate

随着(NH4)2SO4质量分数的增加,分配系数和萃取率逐渐上升,当质量分数达到20%时出现下降趋势。这是因为随着(NH4)2SO4用量的增加,下相水合能力增强,体积增加,而上相体积减小,上相中PEG400相对浓度增加,对黄酮的分配系数增大,表现为萃取率也增大。但当(NH4)2SO4用量继续增加,双水相体系极性增加,使黄酮及水溶性杂质主要存在于下相,相应分配系数减小,相比R也减小,造成萃取率急剧下降,不利于黄酮萃取,与文献[16]结果基本一致。因此(NH4)2SO4最佳质量分数为20%。

2.4 各单因素对双水相体系萃取的影响

2.4.1 pH对双水相萃取效果的影响 体系的pH不同,对于溶液中离子的存在形式、电性产生影响,相间电位差发生变化,从而影响黄酮在两相间的分配系数[17]。

对于PEG400-(NH4)2SO4体系,当pH>7.0时,(NH4)2SO4发生水解,放出氨气,故调节双水相体系pH为2.2～7.0,考察酸性溶液环境对双水相萃取效果的影响,测定结果如图4。当pH<4.0时,松花粉黄酮吸附氢离子带正电荷,逐渐向电位为负的下相富集,体系pH愈小,下相黄酮浓度增加,使得分配系数减小;当pH>4.0时,上相体积增加,相比增大,但是上相PEG相对浓度减小,不利于黄酮的富集,而且随着体系pH接近于7,体系的相间电位差逐渐减小,相间传质减弱,分配系数和萃取率都逐渐下降,但萃取率下降缓慢,因此,可选择pH4.0为适宜的pH条件。

图4 pH对双水相萃取效果的影响Fig.4 Effect of pH on partition ratio and extraction rate

2.4.2 NaCl的添加量对双水相萃取效果的影响 对于双水相体系,当添加NaCl等中性盐电解质时,其电解离子在两相中的不均衡分配会影响该体系的相电位差,或者改变体系溶质的静电荷数,从而影响溶质在两相中的分配系数[18]。

由图5可以看出,随着NaCl添加量的增加,分配系数和萃取率的变化基本同步,出现了先增大后减小的趋势。当较少量的NaCl加入时,随着电解离子在两相间的不均衡分配,使两相之间的电位差增大,分相加速,黄酮更好的萃取到了上相中,分配系数和萃取率都呈现上升趋势;但是当加入的NaCl量继续增多,盐浓度超过2%时,双水相极性增强,出现盐析现象,松花粉黄酮的溶解度变小,从而使分配系数和萃取率都急剧降低,与相关文献[19]结论一致。因此,NaCl添加量适宜选择2%。

图5 NaCl质量分数对双水相萃取效果的影响Fig.5 Effect of mass fraction of NaCl on partition ratio and extraction rate

2.4.3 温度对双水相萃取效果的影响 由图6可以得出,体系温度在40 ℃左右时,表现为较高的分配系数和萃取率。随着温度的升高,溶质扩散速度加快,提高了黄酮在两相间的分配效率,较短时间内实现传质平衡,表现为上相体积减小,PEG和黄酮相对浓度增大,K值急剧上升,萃取率相应提高,当分配系数上升至60时,萃取率达到了98%以上;但温度继续升高时,PEG在下相中的溶解度也增大,造成黄酮分配系数和萃取率的下降,与文献结论基本一致[20]。因此,适合萃取松花粉黄酮的温度为40 ℃左右。

图6 温度对双水相萃取效果的影响Fig.6 Effect of temperature on partition ratio and extraction rate

表4 两种提取方法的比较Table 4 Comparison of two extraction methods

2.5 正交实验结果

以分配系数K、萃取率Y为实验指标,分别对正交实验结果进行极差、方差分析,实验结果见表2、表3。

表2 正交实验直观分析结果Table 2 Results and analysis of orthogonal test

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal test

对于PEG400-(NH4)2SO4双水相体系萃取纯化松花粉总黄酮,由极差R值分析得出,各因素对于分配系数K的影响先后次序为A>B>C,即NaCl质量分数>pH>温度,同时各因素对于黄酮萃取率Y的影响先后次序亦为A>B>C,两者一致。同时方差分析结果显示NaCl质量分数对分配系数和总黄酮萃取率的影响作用均表现出显著性(p<0.05),而温度和pH的影响作用不显著,与对应极差分析结果一致;综合分配系数和萃取率两指标,根据均值k及k′的大小,得出最佳萃取工艺条件为A2B2C2,即双水相体系pH4、温度为40 ℃、NaCl添加量为2.0%。

在此条件下,进行3次重复验证实验,其分配系数分别为K1=69.86、K2=93.70、K3=102.10;萃取率分别为Y1=98.69、Y2=99.02、Y3=99.10,平均分配系数K=88.55、萃取率为98.93%。

2.6 微波辅助双水相萃取

微波辅助双水相萃取法与微波乙醇提取法实验结果见表4。

由表4可知,微波辅助双水相直接萃取松花粉中的总黄酮,相较于微波乙醇法,其得率提高了120%,PEG400-(NH4)2SO4双水相环境促使黄酮更好的富集到了上相中,达到了很好的萃取效果。

3 结论

采用PEG400-(NH4)2SO4双水相体系萃取纯化松花粉中的总黄酮,其双水相体系组成为26%PEG400-20%(NH4)2SO4,各因素对于萃取分配行为的影响程度依次为NaCl质量分数>pH>温度。最佳萃取工艺条件为NaCl添加量为2.0%、pH4、温度为40 ℃,此条件下分配系数K=88.55,萃取率Y=98.93%。此外,微波辅助双水相直接萃取松花粉中的总黄酮,较传统工艺,总黄酮得率提升了120%,可作为松花粉总黄酮等天然活性产物分离纯化的一种有效方法。

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Study on the extraction of total flavonoids from Pine Pollen in PEG400/(NH4)2SO4aqueous two-phase system

SHAO Sheng-juan,WEI Jing-li

(Taiyuan Institute of Technology,Taiyuan 030008,China)

An aqueous two-phase system of PEG400/(NH4)2SO4was used to extract total flavonoids from Pine Pollen. The composition of the aqueous two-phase system was 26%PEG400-20%(NH4)2SO4. Effects of the mass fraction of NaCl,pH and temperature of aqueous two-phase system on the partition ratio and extraction rate of total flavonoids from Pine Pollen were studied through the single factor experiments. The optimal extraction conditions were obtained by the orthogonal experimental design. The optimum conditions were as follows:the mass fraction of NaCl at 2%,pH at 4 and temperature at 40 ℃,and the extraction rate can reach up to 98.93%. The NaCl addition had the most effect on flavonoids partition. The aqueous two-phase extraction has the advantages of simple and convenient procedure,moderate aqueous environment,shorter extraction time and higher extraction rate,which is effective for the separation and purification of total flavonoids.

Aqueous two-phase extraction;partition ratio;extraction rate;total flavonoids;Pine Pollen

2016-11-21

邵圣娟(1987-)，女，硕士，讲师，研究方向：天然产物的提取分离，E-mail：youyou121abc@126.com。

太原工业学院院级科学基金(2014LY03)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)11-0266-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.042