超微粉碎与超声波组合辅助胃蛋白酶水解乳清蛋白效果研究

清 源

(西昌学院农业科学分院,四川西昌 615013)



超微粉碎与超声波组合辅助胃蛋白酶水解乳清蛋白效果研究

清 源

(西昌学院农业科学分院,四川西昌 615013)

本文将超微粉碎技术和超声波技术组合应用于胃蛋白酶水解乳清蛋白效果的研究。目的在于探讨两种技术的联合作用下,胃蛋白酶水解乳清蛋白的效果和规律。在单因素实验的基础上,选取了超微粉碎目数、超声波处理功率、超声波处理时间为影响因子,以水解后可溶性蛋白含量为响应面值,应用响应面设计方法建立数学模型,进行响应面分析。结果表明,获得最佳水解效果的实验因素组合为:超微粉碎目数2000目,超声波处理功率250 W,超声波处理时间50 min。各实验因素对可溶性蛋白含量影响由大到小依次为:超声波处理功率>超声波处理时间>超微粉碎目数。经过最佳实验因素组合处理获得的可溶性蛋白含量为6.03 mg/mL,为未采用组合处理样品可溶性蛋白含量的1.39倍。

超微粉碎,超声波,胃蛋白酶,乳清蛋白

乳清蛋白作为一种优质蛋白,因其具有易消化吸收、氨基酸组分合理等特点而被称为“蛋白之王”,是世界公认的最适宜人体摄取吸收的补充蛋白质之一。目前,乳清蛋白主要是从牛奶中提取获得。但相对人乳而言,牛乳中含量较高的β-乳球蛋白会导致婴幼儿在食用乳清蛋白时发生过敏反应。在婴幼儿奶粉制造的过程中,有效的降低乳清蛋白中β-乳球蛋白的过敏性,具有极其重要意义[1]。对乳清蛋白进行水解是当前降低乳清蛋白中β-乳球蛋白过敏性的主要方法之一[2]。目前,酶解乳清蛋白是较为常用的水解乳清蛋白的方法之一,常用的酶主要有胰蛋白酶、胃蛋白酶等。其原理在于:通过采用这些蛋白酶作用于乳清蛋白之后,可以使β-乳球蛋白过敏性降低[3]。不同类型的蛋白酶作用于乳清蛋白后,对乳清蛋白过敏性降低的效果也不相同。

超微粉碎技术是利用机械粉碎的方法克服物体内部凝聚力并使之破碎的粉碎技术,可以使物料的粒度达到10 μm以下,甚至达到1 μm的超微米水平。超声波技术是利用频率在20～10 MHz的电磁波产生的空化效应,来促进物质溶解的技术[4]。超声波技术被广泛的应用于辅助蛋白质的水解、萃取和改性[5]。研究证明,超微粉碎技术和超声波处理技术都被证明能够有效的辅助不同的蛋白酶进行乳清蛋白的水解:任守国[6]研究发现,胃蛋白酶对超微豆粕粉体中抗原蛋白的消化速度高于常规粉碎豆粕粉体;EI Mecherfi[7]研究发现,超声波技术可以有效的辅助胃蛋白酶水解β-乳球蛋白;Izquierdo[8]研究发现,超声波技术可以破坏β-乳球蛋白的过敏表位,降低其过敏性。本文立足于超微粉碎技术和超声波处理技术应用于乳清蛋白水解效果的研究,通过响应面实验设计方法来探讨两种技术的联合作用下,胃蛋白酶水解乳清蛋白的效果和规律。

表1 不同试管中试剂添加量Table 1 Reagent adding quantity in different test tubes

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳清蛋白 美国HILMAR公司;胃蛋白酶,酶活为3000 U/mg 北京索莱宝科技有限公司;牛血清白蛋白 中国科学院生物物理所生化厂;福林酚 唐河天弘化学品有限公司;考马斯蓝量G-250试剂 北京索莱宝科技有限公司;碳酸钠、氢氧化钠、酒石酸钾钠、无水硫酸铜 上海云岭化工厂。

UV-2500紫外可见分光光度计 日本岛津株式会社;电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器公司;台式离心机 上海安亭科学仪器厂;PHS-3C型pH计 上海雷磁仪器厂;SHB-3型循环水多用真空泵 郑州豫华仪器制造有限公司;磁力加热搅拌器 杭州仪表电机厂;电子天平 上海梅特勒-托利多仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胃蛋白酶水解乳清蛋白工艺过程 参考卞蓉霞[9]的胃蛋白酶的最适反应条件,进行样品制备:准确称量乳清蛋白1.10 g,融于18.90 mL超纯水中,充分搅拌使其溶解后。然后将其置于恒温磁力搅拌水浴锅上,加入55 mg胃蛋白酶启动酶解反应,恒温水浴将溶液加热至胃蛋白酶最适温度40 ℃,并以1 mol/L盐酸进行调节,使溶液pH稳定在胃蛋白酶的最适pH,即pH为2.0。反应4 h后立即将溶液置于100 ℃恒温水浴中灭活10 min。之后先利用超微粉碎技术对实验样品进行处理,再利用超声波处理技术对实验样品进行处理。最后进行测定样品的可溶性蛋白含量。

1.2.2 胃蛋白酶水解乳清蛋白后可溶性蛋白含量的测定 本实验过程中胃蛋白酶水解乳清蛋白后可溶性蛋白含量的测定采用的是福林酚法[10]。实验测定过程如下:

试剂甲的制备:A溶液:10 g碳酸钠,2 g氢氧化钠和0.25 g酒石酸钾钠溶解于500 mL蒸馏水中,现配现用;B溶液:0.5 g无水硫酸铜溶解于100 mL蒸馏水中。每次使用前将A与B液50∶1混合,即为试剂甲。

试剂乙的制备:将福林酚试剂稀释一倍,即为试剂乙。

取水解后的乳清蛋白溶液1 mL,并稀释至50倍,装于10 mL EP管中。加入试剂甲5 mL,摇匀后室温放置10 min,再加入0.5 mL试剂乙,摇匀,继续放置30 min,在650 nm处测定其吸光度。以牛血清白蛋白为标准做标准曲线,计算水解液中的可溶性蛋白的浓度。

标准曲线制作过程:精确称取结晶牛血清蛋白10 mg,加水溶解并定容至100 mL,即为100 μg/mL的标准蛋白质溶液。取6支试管,按照表1添加相应的试剂,盖上塞子摇匀。放置5 min,在650 nm波长下比色测定,比色测定须在1 h内完成。以牛血清蛋白含量为横坐标,以吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。根据标准曲线得:回归方程为y=0.00112x;R2=0.9992。

1.2.3 单因素实验设计 以可溶性蛋白含量为评价指标,固定超微粉碎目数3000目、超声波处理功率150 W,超声波处理时间30 min,考察不同的超微粉碎目数(1000、2000、3000、4000、5000目)、超声波处理功率(50、2000、100、150、200 W)、超声波处理时间(10、20、30、40、50 min)对可溶性蛋白含量的影响。

1.2.4 响应面实验设计 综合单因素实验的结果,应用响应面法进行方案设计[11],以超微粉碎目数(X1)、超声波处理功率(X2)、超声波处理时间(X3)为自变量,可溶性蛋白含量(Y)为响应面值,设计3因素3水平实验对胃蛋白酶水解乳清蛋白的工艺参数进行优化。响应面实验设计因素水平编码表见表2。

表2 响应面实验设计因素水平Table 2 Factors and levels in response surface composite design

1.2.5 实验数据分析 采用design-expert软件进行实验设计及相关数据分析。

2 结果与分析

2.1 对照样品可溶性蛋白含量测定

取未采用超微粉碎和超声波组合处理的样品作为对照样品,测定其可溶性蛋白含量,重复3次,平均值为4.33 mg/mL。

2.2 单因素实验分析

2.2.1 超微粉碎目数对可溶性蛋白含量的影响 由图1可知,随着超微粉碎目数的逐渐增加,可溶性蛋白含量首先呈现出逐渐上升的趋势,当超微粉碎目数为3000目时,可溶性蛋白含量达到最大。之后,随着超微粉碎目数的增加,可溶性蛋白含量呈现出下降趋势。原因可能是:随着超微粉碎目数的增加,物理机械剪应力直接会使乳清蛋白的部分肽键断裂,形成具有可溶性的小片段蛋白质,但在超微粉碎目达到一定程度之后,超微粉碎技术带来的物理机械剪应力对乳清蛋白产生的影响不再增加,反而会因改变了具有可溶性的小片段蛋白质的二级结构而使其可溶性降低,从而导致样品可溶性蛋白含量减少[12]。综合实验结果,超微粉碎目数选择3000目为宜。

图1 超微粉碎目数对可溶性蛋白含量的影响Fig.1 Effect of superfine grinding orders on soluble protein content

2.2.2 超声波处理功率对可溶性蛋白含量的影响 由图2可知,随着超声波处理功率的逐渐增加,可溶性蛋白含量首先呈现出逐渐上升的趋势,当超声波处理功率为200 W时,可溶性蛋白含量达到最大。之后随着超声波处理功率的增加,可溶性蛋白含量呈现出下降趋势。原因可能是:超声波的高频机械振动作用可能会使乳清蛋白的空间构象发生改变,从而导致其亲水性发生变化[13]。综合实验结果,超声波处理功率选择200 W为宜。

图2 超声波处理功率对可溶性蛋白含量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on soluble protein content

2.2.3 超声波处理时间对可溶性蛋白含量的影响 由图3可知,随着超声波处理时间的逐渐增加,可溶性蛋白含量呈现逐渐上升的趋势,并在超声波处理时间超过40 min后逐渐趋于稳定。当超声波处理时间为40 min时,可溶性蛋白含量达到最大。原因可能是:超声波的高频机械振动作用随着时间的推移,在应用初期可能会使乳清蛋白的空间构象迅速发生改变,从而增强其亲水性,但在达到一定时间之后,乳清蛋白的空间构象并不会随着时间的变化而产生重大改变[14]。综合实验结果,因此超声波处理时间选择40 min为宜。

图3 超声波处理时间对可溶性蛋白含量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on soluble protein content

2.3 胃蛋白酶水解乳清蛋白的工艺参数优化实验

2.3.1 优化实验设计 实验设计方案及结果见表3。

表3 实验方案及结果Table 3 Experimental plan and results

2.3.2 回归模型的建立与分析 以超微粉碎目数(X1)、超声波处理功率(X2)、超声波处理时间(X3)为实验设计因素,应用响应面实验设计方法,研究实验设计因素对胃蛋白酶水解乳清蛋白后可溶性蛋白含量(Y)的影响。表3中含有实验结果,表4为回归方程的偏回归系数检验表,表5为方差分析表。回归方程为:

Y=5.52-0.035X1+0.19X2+0.13X3+0.042X12-0.073X22+0.022X32-0.048X1X2+0.028X1X3+0.18X2X3

由表4中回归方程的偏回归系数检验分析结果可知:

表4 回归方程中偏回归系数显著性检验Table 4 Significance test of partial regression coefficient in the regression equation

根据一次项的F值大小,可以判断出各实验因素对可溶性蛋白含量影响由大到小依次为:超声波处理功率>超声波处理时间>超微粉碎目数。

从一次项看,超声波处理功率(X2)、超声波处理时间(X3)的一次项和可溶性蛋白含量呈正相关,超微粉碎目数(X1)的一次项和可溶性蛋白含量呈负相关,其中超声波处理功率(X2)、超声波处理时间(X3)的一次项影响显著。

从二次项看,超微粉碎目数(X1)、超声波处理时间(X3)的二次项和可溶性蛋白含量呈正相关,超声波处理功率(X2)的二次项和可溶性蛋白含量呈负相关,其中超声波处理功率(X2)的二次项影响显著。

从交互项看,超微粉碎目数(X1)与超声波处理时间(X3)的交互项、超声波处理功率(X2)与超声波处理时间(X3)的交互项和可溶性蛋白含量呈正相关,超微粉碎目数(X1)与超声波处理功率(X2)的交互项和可溶性蛋白含量呈负相关,其中超声波处理功率(X2)与超声波处理时间(X3)的交互项影响显著。

由表5方差分析结果可知,在失拟项的F值检验当中,F失拟=4.34

表5 方差分析结果Table 5 Variance analysis results

图4～图6为三个实验因素交互作用的响应面3D及等高线分布图。从响应面的等高线和极值点可以看出,在实验因素交互作用中存在最大值。对比图4～图6中的响应面曲张程度可知,图6的响应面曲张程度最为突出,且图中底部的等高线更加接近于椭圆形,这就意味着超声波处理功率(X2)与超声波处理时间(X3)的交互项影响最为显著。

图4 超微粉碎目数与超声波处理功率的响应面和等高线分析图Fig.4 The analysis diagram of the response surface and contour line between superfine grinding orders and ultrasonic power

图5 超微粉碎目数与超声波处理时间的响应面和等高线分析图Fig.5 The analysis diagram of the response surface and contour line between superfine grinding orders and ultrasonic time

图6 超声波处理功率与超声波处理时间的响应面和等高线分析图Fig.6 The analysis diagram of the response surface and contour line between ultrasonic power and ultrasonic time

2.3.3 回归模型最优实验组合选择 采用design-expert软件包的optimization choices工具箱对回归方程进行分析处理,可以得到超微粉碎与超声波组合处理对胃蛋白酶水解乳清蛋白最佳的实验因素组合为:超微粉碎目数1999.99目,超声波处理功率249.54 W,超声波处理时间49.83 min。考虑到实际操作的可行性,最佳的实验因素组合取值应为:超微粉碎目数2000目,超声波处理功率250 W,超声波处理时间50 min。此时,胃蛋白酶水解乳清蛋白后的可溶性蛋白含量的理论最大值为6.06 mg/mL。

2.3.4 回归模型最优实验组合验证 用超微粉碎与超声波组合处理对胃蛋白酶水解乳清蛋白最佳的实验因素组合:超微粉碎目数2000目,超声波处理功率250 W,超声波处理时间50 min进行三次重复实验,分别测定所得样品的可溶性蛋白含量,得到三次实验样品的可溶性蛋白含量平均值为6.03 mg/mL。理论的可溶性蛋白含量为6.06 mg/mL,二者的相对误差为0.49%,在允许的范围内,说明模型拟合度较高,预测准确。

2.3.5 超微粉碎与超声波组合处理前后可溶性蛋白含量对比分析 由验证实验的结果可知,采用最优的实验因素组合,可获得可溶性蛋白含量为6.03 mg/mL,为对照样品可溶性蛋白含量的1.39倍。说明采用超微粉碎与超声波组合处理可以有效促进胃蛋白酶水解乳清蛋白。原因可能是:超微粉碎与超声波组合处理既会影响到乳清蛋白的空间构象使其亲水性增加,又可能会因超微粉碎技术的物理机械剪应力而使乳清蛋白的部分肽键断裂,形成具有可溶性的小片段蛋白质[15]。

3 结论

本实验通过响应面优化实验设计,得出各实验因素对可溶性蛋白含量影响由大到小依次为:超声波处理功率>超声波处理时间>超微粉碎目数。最佳水解效果的实验因素组合为:超微粉碎目数2000 目,超声波处理功率250 W,超声波处理时间50 min。在此条件下,胃蛋白酶水解乳清蛋白后的实际可溶性蛋白含量为6.03 mg/mL,为对照样品的可溶性蛋白含量的1.39倍,说明采用超微粉碎与超声波组合处理可以有效促进胃蛋白酶水解乳清蛋白。

[1]谢秀玲,李欣,陈红兵，等.β-乳球蛋白的聚合及特性研究进展[J].食品科学,2015(9):42-45.

[2]孙洋,钱方,赵磊，等.乳清蛋白酶解条件优化[J].食品与机械,2015(1):67-69.

[3]石丹,王彩云,云战友. 碱性蛋白酶水解乳清蛋白工艺条件的研究[J].中国食品学报,2011,(01):39-43.

[4]郭武汉,关二旗,卞科.超微粉碎技术应用研究进展[J].粮食与饲料工业,2015,(5):38-40.

[5]陈芳芳,孙晓洋,王兴国，等.超声波技术在油脂工业中的应用和研究进展[J].中国油脂,2012(10):37-39.

[6]任守国.超微粉碎豆粕的理化营养特性研究[D].都江堰:四川农业大学,2009.

[7]El Mecherfi K E,Saidi D,Kheroua O,et al. Combined ultrasonic wave and enzymatic treatments forβ-lactoglobulin and bovine whey proteins and their effect on the IgE immunoreactivity[J]. European Food Research and Technology,2011,33:859-867.

[8]Izquierdo F J,Inteaz A,Yaylayan V,et al. ultrasonic wave assisted digestion ofβ-lactoglobulin by pronase,a-chymotrypsin and pepsin[J]. International Dairy Journal,2007,17:465-470.

[9]卞蓉霞.微波辅助水解乳清蛋白研究[D].无锡:江南大学,2013.

[10]牛雪. 福林酚法测定葡萄酒总酚的优化研究[D].银川:宁夏大学,2015.

[11]潘丽军. 实验设计与数据处理[M]. 南京:东南大学出版社,2008.

[12]孙婵婵,张民,田朝杰. 超微粉碎-微粒化组合技术对乳清蛋白结构和加工特性的影响[J].现代食品科技,2015,31(12):263-265.

[13]Chen Li,Xingjian Huang,Qiang Peng,et al. Physicochemical properties of peanut protein isolate-glucomannan conjugates prepared by ultrasonic treatment[J]. Ultrasonics-Sonochemistry. 2014(5):159-163.

[14]Hao Hu,Jiahui Wu,Eunice C.Y. Li-Chan,et al. Effects of ultrasound on structural and physical properties of soy protein isolate(SPI)dispersions[J]. Food Hydrocolloids,2013(2):86-91.

[15]余丹丹,张昊,郭慧媛,等. 乳清蛋白的特性及其在食品工业中的应用[J]. 中国乳业. 2013(06):46-49.

Resarch of the superfine grinding and ultrasonic assisted hydrolysis on the whey protein by pepsin

QING Yuan

(School of Agricultural Science of XiChang College,Xichang,615013,China)

This paper applied the combination of superfine grinding technology and ultrasonic technology to the research of the effect of the protein hydrolysis of whey pepsin.The impact factors including superfine grinding orders,ultrasonic power,ultrasonic time were investigated by response surface design based on the single factor experiment,with the content of soluble protein as the responses,also the mathematical models were established. The results showed that the best experiment combination factors of hydrolysis effect were superfine grinding orders 2000 of order,ultrasonic power of 250 W,ultrasonic time of 50 min. The significance of every experiment factors on the content of soluble protein was decreased according to ultrasonic power>ultrasonic time>superfine grinding orders. Under the optimal experiment combination factors,the content of soluble protein was 6.03 mg/mL,which was 1.39 times of the content of soluble protein that was not dealt with experiment combination factors.

superfine grinding;ultrasonic;pepsin;whey protein

2016-10-24

清源(1983-)，女，博士研究生，讲师，研究方向：食品科学，E-mail:64899867@qq.com。

TS201.3

B

1002-0306(2017)11-0235-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.036