Beclin1、MAP1LC3B和mTOR在宫颈病变中的表达及临床意义

张 晶,舒丽莎,陈江平,张林西

(1.河北北方学院研究生部,河北 张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院妇产科,河北 张家口 075000；3.河北北方学院生命科学研究中心,河北 张家口 075000)

Beclin1、MAP1LC3B和mTOR在宫颈病变中的表达及临床意义

张 晶1,舒丽莎2,陈江平2,张林西3

(1.河北北方学院研究生部,河北 张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院妇产科,河北 张家口 075000；3.河北北方学院生命科学研究中心,河北 张家口 075000)

目的 检测Beclin1、MAP1LC3B及mTOR在宫颈病变中的表达，并探讨其临床意义。方法 采用免疫组织化学方法，检测宫颈病变中Beclin1、MAP1LC3B及mTOR的表达，并与正常宫颈组织对照。结果 Beclin1在正常宫颈组、低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)组、高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)组和宫颈鳞癌组中的阳性表达率分别为95.00%、84.00%、62.00%及34.00%；MAP1LC3B的阳性表达率分别为90.00%、86.00%、54.00%及22.00%；mTOR阳性表达率分别为35.00%、44.00%、72.00%及86.00%，不同组中的表达差异均有统计学意义(P<0.01)。在宫颈癌患者中，Beclin1阳性表达与淋巴转移及临床分期相关，MAP1LC3B阳性表达与肿瘤分化相关，mTOR的阳性表达则与淋巴转移相关。MAP1LC3B与Beclin1的表达呈正相关而与mTOR的表达呈负相关。结论 自噬相关基因所反应的自噬水平随着宫颈病变的进展而下降，推测自噬功能缺失可能是促使宫颈病变持续发展的原因之一。

自噬；Beclin1；MAP1LC3B；mTOR；宫颈病变

随着日渐普及的筛查及完善的“三阶梯”诊疗程序，宫颈癌的死亡率大幅下降[1]，但宫颈病变的发病呈现年轻化趋势[2]。宫颈癌的治疗不再局限于手术切除及放、化疗，还需追求破坏性小且精准的疗法，以期延长病患生命甚至达到临床治愈的效果。逐渐成熟的分子靶向治疗可能为其提供新思路，为寻找合适的治疗靶点，细胞程序性死亡(programmed cell death)逐渐成为关注焦点。逃避PCD是恶性肿瘤的特征之一[3]。自噬是将异常蛋白质及衰竭细胞器借助溶酶体降解并重新利用后以维持细胞内环境稳态的过程，其过度激活可能导致的Ⅱ型程序性死亡[4]为靶向杀伤肿瘤提供了新的研究方向。Beclin1、MAP1LC3B和mTOR是调节自噬活性、鉴定自噬水平的关键基因。其中，Beclin1作为自噬程序的启动子，正向调节自噬功能；mTOR作为逆向调控的枢纽，抑制细胞自噬行为；MAP1LC3B是自噬体模性结构的标记者，其表达水平反映自噬活性的强弱。

本研究利用免疫组化方法从正启动及负反馈的双方向同时检测Beclin1、MAP1LC3B和mTOR在正常宫颈、低级别鳞状上皮内病变(low-grade suamous intraepithelial lesion,LSIL)、高级别鳞状上皮内病变(high grade suamous intraepithelial lesion,HSIL)及宫颈鳞状细胞癌组织中的表达，探讨自噬活性与各级宫颈病变及宫颈癌临床病理因素之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

所有标本取自2013—2015年河北北方学院附属第一医院病理科保存的蜡块组织，其中LSIL50例、HSIL50例、宫颈鳞状细胞癌50例，患者年龄21～65岁，中位年龄47岁。所有患者术前均未接受药物治疗及放、化疗，另取同期因子宫肌瘤行全子宫切除的正常宫颈组织20例作为对照。根据第4版WHO(2014)女性生殖系统肿瘤分类标准，由2位病理医师经双盲法重新阅片诊断。研究遵循的程序获得本院医学伦理委员会批准。

1.2 试剂与方法

Beclin1兔多克隆抗体购自abcam公司(ab62557),稀释浓度为1∶200；MAP1LC3B兔多克隆抗体购自abcam公司(ab648394),稀释浓度为1∶150；mTOR兔单克隆抗体购自abcam公司(ab32028),稀释浓度为1∶150。免疫组化Super Vision试剂盒(SV0002)及DAB显色液均购自武汉博士德生物技术有限公司。石蜡包埋标本，3 μm连续切片，采用Super Vision法，APES防脱载玻片捞片烘干后脱蜡、至水，枸橼酸修复抗原；3%H2O2常温孵育10 min，以避免内源性过氧化物酶干扰；5%BSA封闭10 min，加一抗Beclin1(1∶200)、LC3(1∶150)、mTOR(1∶150)4 ℃过夜，复温后经磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)冲洗，滴加聚合HRP标记抗兔IgG 37 ℃孵育30 min后DAB显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化，脱水，透明，封片。用已知的阳性照片作为阳性对照，PBS代替一抗做阴性对照。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.3 免疫组化结果判定

Beclin1定位于胞膜和胞质，以胞质为主；MAP1LC3B定位于胞核和胞质，以胞质为主；mTOR定位于胞质。阳性为胞质或非胞质中出现淡黄色至棕褐色颗粒。为兼顾阳性染色的程度和阳性细胞的数目，从整张切片中任意选取10个高度视野进行综合评分，每个视野计数100个细胞。按细胞染色比例计分:阴性计0分，阳性细胞数≤10%计1分，11%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分；依染色强度计分:未着色计0分,淡黄色计1分，黄色计2分，棕褐色计3分，判断染色强度时需与非特异性着色和背景着色对比[5]。将上述2项结果相乘后，≥4分定为阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件处理数据。计数资料即Beclin1、MAP1LC3B及mTOR的表达情况及其与临床病理特征的相关性分析采用卡方检验或Fisher精确概率法；相关性通过Spearman相关性分析实现。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Beclin1、MAP1LC3B及mTOR的表达情况

在正常宫颈组、LSIL组、HSIL组及宫颈鳞状细胞癌组中Beclin1呈不同程度的阳性表达，主要见于胞质中，偶见胞膜表达(图1)，阳性表达率分别为95.00%、84.00%、62.00%及34.00%，差异有统计学意义(P<0.01)，正常宫颈组与HSIL组、宫颈癌组间差异有显著性(P<0.01)。MAP1LC3B阳性表达主要见于胞浆，强阳性时，细胞间质和细胞核中亦见表达(图2)，各组阳性表达率分别为90.00%、86.00%、54.00%及22.00%，差异有统计学意义(P<0.01)，正常宫颈组与HSIL组、宫颈癌组间差异有显著性(P<0.01)。mTOR的阳性表达均位于胞浆中(图3)，各组阳性表达率分别为35.00%、44.00%、72.00%及86.00%，HSIL组、宫颈癌组阳性表达率明显高于正常宫颈组及LSIL组，差异有统计学意义(P<0.01)。

A：Beclin1在正常宫颈中呈阳性表达；B：Beclin1在LSIL中呈阳性表达；

图1 Beclin1在不同宫颈组织中的表达(Super Vision法,×400)

A：MAP1LC3B在正常宫颈中呈阳性表达；B：MAP1LC3B在LSIL中呈阳性表达；

图2 MAP1LC3B在不同宫颈组织中的表达(Super Vision法,×400)

A：mTOR在正常宫颈中呈阴性表达；B：mTOR在LSIL中呈阴性表达；

图3 mTOR在不同宫颈组织中的表达(Super Vision法,×400)

2.2 Beclin1、MAP1LC3B及mTOR在宫颈鳞癌中的表达与临床病理因素之间的关系

Beclin1的表达与淋巴结转移及肿瘤临床分期有关(P<0.01)，即在有淋巴结转移的患者中呈低表达，且临床分期越高，表达量越少；MAP1LC3B的表达与肿瘤分化程度相关(P<0.01)，在中低分化的患者中呈低表达；而mTOR的表达与有无淋巴结转移相关，且在有淋巴结转移的患者中呈现明显高表达(P<0.05)(表1)。

2.3 宫颈鳞癌组织中Beclin1、MAP1LC3B及mTOR表达的相关性

通过Spearman相关性分析，Beclin1与MAP1LC3B在宫颈鳞癌组织中表达呈正相关(r=0.434，P<0.01)，MAP1LC3B与mTOR的表达呈现负相关(r=-0.481，P<0.01)，而Beclin1与mTOR的表达未呈现明显相关(r=0.046，P>0.05)。

表1 Beclin1、MAP1LC3B及mTOR的表达与宫颈鳞状细胞癌临床病理特征的关系

3 讨 论

自噬是细胞为维持内环境稳态而借助溶酶体达到内源性底物循环再利用的过程。过度的自噬活性所导致的程序性死亡是机体淘汰衰老细胞、清理病原体的一种途径。基于细胞的这一节能且有效的循环功能，研究人员将自噬作为一种新的思路，探究肿瘤细胞增殖、发展、转归及预后与自噬的关系，通过调整自噬水平控制病变进展甚至有效杀伤肿瘤细胞。因为其在生物进化过程中的高度保守，所以无论是酵母还是人体，均可以找到同源的自噬相关基因[6]。

作为诱导诸多自噬因子定位于前自噬体的关键基因，Beclin1为哺乳动物参与自噬过程的特异基因，与酵母自噬相关基因(autophagy related genes,ATG)ATG6同源。Beclin1结合III型磷酸肌醇-3-激酶(class III phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K3C)后，形成启动自噬的核心复合物，同时参与其他自噬相关基因的编码产物定位于自噬前体中，从而正向调控自噬活性[7]。目前已有研究证实，在肺癌[8]、卵巢癌[9]、子宫内膜样腺癌[10]、乳腺癌、黑色素瘤中出现Beclin1蛋白表达的下降[11]，其抑癌作用不容忽视。本研究中Beclin1的表达率在各组间差异显著，尤其是HSIL组和宫颈鳞癌组中Beclin1的表达显著低于正常宫颈组和LSIL组,提示自噬活性的启动在癌细胞中甚至是高级别病变已部分缺失。另外Beclin 1的表达与宫颈鳞癌临床分期及淋巴结转移相关，Beclin1的低表达导致自噬活性缺失，可能助力了病变进展及淋巴结的转移，这一结果与Ding等[12]在肝癌中的研究相一致，Beclin1的低表达与更具侵袭性的肝癌细胞表型及预后不良相关。

微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1 lightchain3,MAP1LC3,LC3)基因是酵母ATG8的同源基因，其表达产物LC3A定位于自噬泡双侧膜结构中的内层，随着自噬过程被启动，与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3B，LC3B的含量直接反应自噬体的数量，被认为是自噬活性的特异性灵敏标志分子[13]。本研究结果显示，HSIL组及宫颈鳞癌组中LC3B多以阴性表达，表达水平显著低于正常宫颈组及LSIL组，同时在宫颈鳞癌组中随着组织分化程度的下降，LC3B表达水平降低，提示异型性明显的细胞可能逃脱了自噬消除甚至抑制了自噬活性。在局部乳癌化疗后复发的探究中，研究人员发现表达LC3B的患者预后较好，提示LC3B可作为该疾病甚至其他恶性肿瘤预后的阳性指标[14]。

mTOR作为自噬生物学功能的中心调控者，是多条自噬通路的核心枢纽，负向调控自噬体的诱导及形成。已有文献证实mTOR参与人乳头瘤病毒感染所导致的口咽癌和宫颈鳞状细胞癌的发生[15]。本研究中，mTOR在宫颈鳞癌组的表达量远远高于其他组，同时在淋巴结转移中呈现高表达，提示mTOR作为自噬活性的门控开关，PI3K/Akt/mTOR通路的激活[16]可能加速宫颈癌的恶化，促进淋巴结转移，进而影响预后。

综上，Beclin 1、MAP1LC3B随着宫颈病变的进展而表达下降，其反映的自噬活动随着病变的严重程度而有所缺失，同时自噬活性的负调节因子mTOR在HSIL组及宫颈癌组中的表达升高，进一步提示自噬缺失可能与宫颈病变的发生、发展关系密切。通过正激活、负抑制两个方向，联合检测Beclin1、MAP1LC3B与mTOR在宫颈病变中的表达，有助于更加全面评估自噬活性与病变进展程度及宫颈癌预后的关系。提升自噬活性，诱导病变细胞程序性死亡，可能成为阻止病情恶化，靶向治疗宫颈病变甚至宫颈癌的精准医疗手段。

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[责任编辑：李蓟龙 英文编辑：刘彦哲]

Expression of Beclin1,MAP1LC3B and mTOR and Their Clinical Significance in Cervical Lesions

ZHANG Jing1,SHU Li-sha1,CHEN Jiang-ping1,ZHANG Lin-xi2

(1.Graduate Faculty,Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,The First Affiliated Hospital of Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China; 3.Life Science Center,Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China)

Objective To detect the expression of Beclin1,MAP1LC3B and mTOR in cervical lesions and explore their clinical significance.Methods The protein expression of Beclin1,MAP1LC3B and mTOR were evaluated by immunohistochemistry in cervical lesions.In addition,the expression was compared with normal cervical tissue.Results The positive expression rates of Beclin1 in normal cervical group,LSIL group,HSIL group and cervical squamous cell carcinoma group were 95.00%,84.00%,62.00% and 34.00%,respectively.The positive expression rates of MAP1LC3B in these groups were 90.00%,86.00%,54.00% and 22.00%.The positive expression rates of mTOR were 35.00%,44.00%,72.00% and 86.00%.The expression differences of three kinds of proteins in different groups were statistically significant(P<0.01).In cervical squamous cell carcinoma group,the expression of Beclin1 was correlated with clinical stage and lymphatic metastasis,MAP1LC3B with differentiation and mTOR with lymphatic metastasis.The expression of LC3 was positively correlated with Beclin1 and negatively with mTOR in cervical squamous cell carcinoma.Conclusion The level of autophagy,reflected by the key genes of autophagy,decreases with the progress of cervical lesions,and it is speculated that the defect of autophagy may be one of the reasons for the continuous development of cervical lesions.

autophagy;Beclin1;MAP1LC3B;mTOR;cervical lesion

河北省重大医学科研课题(No.zd2013053)；政府资助省级临床医学优秀人才项目(No.361009)

张晶(1989-)，女，河北张家口人，河北北方学院2014级研究生。

舒丽莎(1958-)女，北京人，硕士，主任医师，教授，硕士研究生导师，研究方向：妇科肿瘤。

R 711.74

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2017.06.001

来稿日期：2017-03-28