产壳聚糖酶土壤微生物的筛选鉴定及发酵条件优化

毛贵珠++章晔敏++邵一凡++熊妍妍++陈小娥++方旭波

摘要：对浙江舟山虾蟹养殖场附近的土壤进行针对性地采样，通过壳聚糖平板初筛、摇瓶复筛获得一株具有产壳聚糖酶活性的菌株，编号为ZJOU-AC1。通过形态观察、ITS全序列分析及系统发育进化树的构建，确定ZJOU-AC1为鹿皮色曲霉（Aspergillus cervinus）。对其产酶条件进行初步优化，经优化后的培养基成分为胶体壳聚糖1.5%，（NH4）2SO4 0.4%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%。最适发酵周期为96 h。ZJOU-AC1产酶活力由2.05 U/mL提高到4.85 U/mL，与优化前相比提高了2.36倍。

关键词：壳聚糖酶，土壤，菌株筛选，菌株鉴定，发酵条件，优化

中图分类号：TQ925 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）10-1913-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.029

Screening and Identification of Chitosanase-producing Microorganisms from Soil and Optimization of the Fermentation Conditions

MAO Gui-zhua，ZHANG Ye-mina，SHAO Yi-fana，XIONG Yan-yana，CHEN Xiao-ea，FANG Xu-boa，b

（a.College of Food and Medicine；b.State Key Laboratory of Aquatic Products Processing of Zhejiang Province，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022，Zhejiang， China）

Abstract： In order to screen desirable strains， we take sample of soil from areas adjacent to manufacturing locations of those plants which culture shrimps and crabs in Zhoushan. In this study，we had isolated a high Chitosanase-producing fungus ZJOU-AC1 from the soil by primary screening of plate specula and shaking cultivation. Based on standard morphological，physiological properties，ITS rDNA sequence and the construction of phylogenetic tree，the fungus ZJOU-AC1 was identified as Aspergillus cervinus. We also optimized the fermentation conditions to increase its productivity of chitosanase. The optimum medium components for chitosanase production by fungus ZJOU-AC1 were determined and listed as follows：colloid chitosan 1.5%，（NH4）2SO4 0.4%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%. The optimum fermentation period is 96 h. The maximal chitosanase activity could reach 4.85 U/mL when ZJOU-AC1 was incubated in flask under the optimum cultural conditions. The activity increased by 2.36 times in comparison with initial activity of 2.05 U/mL.

Key words：chitosanase；soil；strain screening；strain identification；fermentation condition；optimization

壳聚糖是甲壳素脱N-乙酰基的产物，在自然界中储量丰富，具有安全、无毒、抑菌、成膜、可降解、可食用等多种特性[1]，但其分子量大，晶体结构紧密，水溶性差，在开发应用上存在一定局限性[2]。根据已有文献报道，通过降解壳聚糖可得聚合度在20以下的壳寡糖，其水溶性好且易被吸收。由于具备独特的功能性质，壳寡糖在废水处理、食品工业、日用化学品、纺织、化工、农业、生物工程和医药等方面均具有广泛的应用前景[3-5]。

壳聚糖的水解方式一般有化学法、物理法和生物酶法，其中，生物酶法是利用非专一或专一性酶对壳聚糖进行降解产生壳寡糖的方法，具有反应过程容易控制、专一性高和反应条件温和等优点。虽然已报道有30多种非专一性酶能降解壳聚糖[6]，但这些商品酶制剂的水解效率并不高，也尚未被证实是否含壳聚糖酶（EC3.2.1.132）。壳聚糖酶是一种专一性水解酶，是酶法降解壳聚糖研究的重要内容[7]。同时，从自然环境中寻找到产壳聚糖酶的新菌株也是壳聚糖应用研究的关键内容[8]。

本研究目的是首先从浙江省舟山市毗邻的常年养殖虾蟹的养殖场附近的山坡及海域筛选壳聚糖酶产生菌株，在此基础上，通过复筛确定产酶能力较强的菌株，并进一步通过发酵条件优化提高其产酶能力，以期获得较好的壳聚糖酶产生菌株，为酶法降解殼聚糖的研究提供高产菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 样品采集于浙江省舟山市定海区五雷山及浙江省舟山市沈家门水产加工厂旁的海滩。在采样地区分别确定5个采样点，在确定的采样点上，先用土铲去除表层5 cm左右的土壤，然后倾斜向下去除片状土壤，将各采样点土壤集中在一起混合均匀，各取50 g左右装入无菌袋中带回。

1.1.2 试剂 壳聚糖由浙江普陀新兴药业有限公司提供，脱乙酰度≥90%；胶体壳聚糖为实验室自制，参考孙玉英等[9]研究；其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器 恒温生化培养箱SPX-250B型（上海福玛实验设备有限公司）；双人净化工作台SW-CJ-2D型（苏州净化设备有限公司）；自动高压灭菌锅 LMQ—R3260（上海昨非实验室设备有限公司）；UV-6000紫外分光光度计（苏州江东精密仪器有限公司）；HHS电热恒温水浴锅（上海棱光技术有限公司）；BS110电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；光学显微镜（Leica DM500）；冷冻离心机（Thermo LEGEND MICRO 17R）。

1.1.4 培养基 斜面保藏培养基：马铃薯琼脂培养基（PDA培养基）；初筛培养基（胶体壳聚糖平板）：A液为1%胶体壳聚糖（1%的醋酸溶解，调节pH至5.5～5.8），B液为酵母粉0.1%，（NH4）2SO4 0.2%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，琼脂2%；液体培养基（复筛液体培养基）：胶体壳聚糖1%，（NH4）2SO4 0.2%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 5.5；种子培养基：胶体壳聚糖0.2%，葡萄糖1%，KH2PO4 0.2%，（NH4）2SO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，自然pH。以上培养基均在121 ℃下灭菌20 min，其中A、B液分开灭菌后再等体积混合。

1.2 方法

1.2.1 产酶菌株的分离 每份样品取土样10 g置于100 mL含有无菌生理盐水的三角瓶（6颗玻璃珠）中，在150 r/min，30 ℃摇床振荡培养30 min。将土壤样品混合液进行梯度稀释，得到10-1～10-5稀释度的土壤稀释液。分别取1 mL涂布于胶体壳聚糖平板上，30 ℃恒溫培养3～4 d。挑选具有壳聚糖水解透明圈的菌落于另一胶体壳聚糖平板上划线纯化，于30 ℃烘箱中经PDA斜面培养2～3 d后移入4 ℃冰箱中保存，备用。

1.2.2 产酶菌株的筛选与纯化 ①平板透明圈初筛与确认。将分离得到的菌株在胶体壳聚糖平板上平行划线，倒平板时注意控制各平板的厚度大致相同，30 ℃培养5～6 d。每天测量并记录各菌落的直径（d）以及各菌落周围的透明圈直径（D），以d值和D/d值大小为指标挑选降解壳聚糖能力较强的菌株，选择透明圈与菌落直径比较大的菌株作为进一步复筛的出发菌株。②产酶菌株的纯化。通过划线分离以达到纯化培养的目的，即选取在胶体壳聚糖平板上形成的透明圈直径与菌落直径比较大的菌落，对其进行多次划线纯化培养，然后挑取单菌落接种到PDA斜面培养基上，于30 ℃烘箱中培养3～4 d，后移入 4 ℃冰箱中保存，备用。③菌株的复筛。从PDA斜面培养基中刮取一菌环接入种子培养基中（装液量75 mL/250 mL三角瓶），在30 ℃、150 r/min的摇床中培养2 d。将种子培养中得到的各菌株分别以1/15 mL培养基的量接种到复筛液体培养基中（装液量75 mL/250 mL三角瓶），于30 ℃、150 r/min条件下振荡培养7 d，每隔12 h测定一次发酵液的酶活力。将离心后的发酵液上清液稀释100倍测定酶活，酶活测定方法为3，5-二硝基水杨酸（DNS）法[10]。最终综合考虑酶活及产酶菌株初筛结果，选择高产壳聚糖酶菌株。

1.2.3 菌种鉴定 ①形态学观察。将优势菌株划线于胶体壳聚糖平板中，30 ℃培养5～6 d以获得细菌的单菌落，利用光学显微镜和菌体染色制片对菌株进行形态特征观察并拍照。同时，依据魏景超[11]的《真菌鉴定手册》对菌种进行初步鉴定。②ITS全序列分析。菌株的ITS序列鉴定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成[12]。

1.2.4 发酵条件的优化研究 单因素试验：①碳源对产酶的影响。在液体培养基中，分别以葡萄糖、乳糖、淀粉、氨基葡萄糖以及乙酰氨基葡萄糖代替复筛液体培养基中的胶体壳聚糖作为碳源（碳源浓度为1%），考察不同碳源对产酶的影响。在此基础上改变碳源浓度，分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，考察不同浓度的碳源对产酶的影响。②氮源对产酶的影响。在液体培养基中，分别以牛肉膏、硝酸钠、蛋白胨、氯化铵、酵母粉代替复筛液体培养基中的硫酸铵（氮源浓度为0.2%），考察不同氮源对产酶的影响。在此基础上，固定碳源浓度，改变氮源浓度，分别为0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%，考察不同浓度的氮源对产酶的影响。数据分析：每个试验点取3组平行样，最终的测量值取平均值[13]，3组平行样的误差控制在5%以内。

2 结果与分析

2.1 菌株初筛结果

从采集的土样筛选到13株有产酶能力的菌株，经过进一步筛选、分离和纯化，挑取菌落周围产生明显的水解透明圈，并且水解圈直径和菌落直径的比值（D/d）较大的6株，编号分别为ZJOU-AC1、ZJOU-AC2、ZJOU-AC3、ZJOU-AC4、ZJOU-AC5和ZJOU-AC6（表1）。

2.2 菌株复筛

根据菌株在胶体壳聚糖平板上产生透明圈直径和菌落直径的比值（D/d）大小进行初步筛选是可行的，但透明圈的大小并不能完全反映菌株的产酶能力，因为菌落周围透明圈的大小除了与产酶能力有关，还与菌株本身产生的壳聚糖酶的种类有关[6]。因此，通过摇瓶复筛来达到精选的目的。将已纯化的具有较强产壳聚糖酶能力的6株菌进行摇瓶复筛，测每株菌株0～7 d的最高酶活力（表2）。

由图1可以看出，菌株ZJOU-AC1最高酶活力达2.05 U/mL，为产酶活力最高的菌株，也是初筛中透明圈直径与菌落直径比值最大的菌株。综合考虑两者结果，将ZJOU-AC1作为进一步研究的试验菌株。

2.3 菌株ZJOU-AC1鉴定

2.3.1 菌株ZJOU-AC1的形态观察及镜检 菌株ZJOU-AC1的菌落特征：菌株在胶体壳聚糖平板以及PDA培养基上均能良好生长。菌株在胶体壳聚糖平板上的菌落直径为5.5～6.5 mm，米白色，表面粗糙、隆起、呈馒头形、絮状、结构疏松且边缘整齐；在PDA培养基上，菌落生长前期呈米白色，后期微黄且不透明。菌株ZJOU-AC1的显微镜形态特征：较多分支的有隔菌丝及其顶端的孢子和孢子囊，子囊壳有包被，无孔口，分生孢子串生。参照魏景超[11]的研究，菌株ZJOU-AC1与曲霉（Aspergillus）的形态特征描述基本一致。

2.3.2 ITS rDNA序列克隆结果 PCR扩增片段经1%琼脂糖电泳后，获得1条约600 bp大小的特异DNA带（图3），基因组DNA的条带清晰，无降解。

2.3.3 ITS全序列分析 真菌核糖体基因包括4种，分别为28S rDNA，5S rDNA，18S rDNA和5.8S rDNA，相互之间由间隔区（Internal Transcribed Space，ITS）分隔。真菌的ITS序列包括ITS1和ITS2两部分，其进化速度快，具有多态性，适用于对亲缘关系较近的菌株进行区分鉴定。

将菌株ZJOU-AC1进行36次纯化培养的单菌落进行ITS序列测定，将菌株ZJOU-AC1的ITS基因序列在NCBI官网中使用Nucleotide BLAST比对，选取该菌种使用MEGA构建系统发育树（图4）。由图4可知，菌株ZJOU-AC1的ITS序列与Aspergillus cervinus的同源性达到99%以上。结合菌株形态观察、显微特征以及ITS同源性分析，鉴定菌株ZJOU-AC1为鹿皮色曲霉（Aspergillus cervinus）。

2.4 菌株ZJOU-AC1的产酶曲线

将菌株ZJOU-AC1接种到液体培养基中，于30 ℃、150 r/min摇床中培养0～7 d，每隔12 h测定酶活一次。

由图5可知，前24 h产酶量极低，自24～96 h产酶量迅速增长，到96 h为最大产酶量，其酶活力达2.05 U/mL，自96～120 h，产酶量几乎保持恒定，120 h之后缓慢减弱。

2.5 培养条件优化

2.5.1 碳源对产酶的影响 由表3可知，在浓度均为1%的葡萄糖、乳糖、淀粉、胶体壳聚糖、氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖6种碳源中，最适合菌株ZJOU-AC1产酶的是胶体壳聚糖，以葡萄糖、乳糖、淀粉等作为碳源时，菌株ZJOU-AC1产酶效果相对较差。由图6可知，酶活最高时对应的胶体壳聚糖浓度为1.5%，此时测得菌株ZJOU-AC1酶活为3.28 U/mL，故1.5%为最适碳源浓度。

2.5.2 氮源对产酶的影响 由表4可知，在硫酸铵、硝酸钠、牛肉膏、氯化铵、酵母粉、蛋白胨6种不同氮源中，硫酸铵和酵母粉的效果较好。但两者所对应酶活大小相差甚小，综合经济成本考虑，选择硫酸铵为该菌株产酶的最适氮源。由图7可知，硫酸铵浓度达到0.4%时，酶活可达4.85 U/mL，故0.4%为最适氮源浓度。

3 小结与讨论

国内外相关研究表明，壳聚糖有抗菌抑菌、抗肿瘤等功效[13，14]。由降解壳聚糖加工制成的壳寡糖产品在国外已广泛应用于生物医药、保健食品、农林畜牧等领域[15，16]，但中国尚无商品化壳寡糖的产品的问世。因此，筛选具有高效产壳聚糖酶能力的菌株并进一步优化其产酶条件显得至关重要。

浙江舟山是海洋大省，也是水产加工大省，每年均有大量甲壳素资源无法合理利用，这些甲壳素资源往往堆积在各海域海滩或一些常年养殖虾蟹的厂家生产场地附近。由于海洋中蕴含的甲壳素资源极其丰富，因此，在长期的能量代谢、循环利用以及生物进化过程中，必然会产生很多独特的降解壳聚糖的菌种，这些菌种分布在海域海滩及山坡的可能性较大[7]。因此，本研究从海滩以及一些毗邻常年养殖虾蟹的厂家生产场地附近的山坡采样。

本研究以胶体壳聚糖为碳源才能诱导菌株ZJOU-AC1高效产酶，在此条件下测得菌株ZJOU-AC1酶活远远高于以葡萄糖、乳糖、淀粉等作为碳源时所测得的酶活，说明该菌为较专一的壳聚糖酶降解菌，且其所產壳聚糖酶为诱导酶，这与康立新等[17]的报道基本一致。

已报道的能产壳聚糖酶的微生物种类较多，包括细菌（Bacillus[18]、Pseudomonas[19]、Arthrobacter[20]、Sphingomon[21]），放线菌（Keratanolyticum[22]），霉菌（Penicillium[23]、 Aspergillus[24]）等，但其中能高效产壳聚糖酶的菌株较少。如阎贺静等[25]在其研究中筛选所得烟曲霉（Aspergillus fumigatus）经发酵条件优化后最高酶活力为3.1 U/mL，尹爱国等[2]在其研究中筛选所得菌株经发酵条件初步优化后酶活为0.272 U/mL。本研究筛选所得的鹿皮色曲霉（Aspergillus cervinus），经产酶条件优化后，酶活力从最初的2.05 U/mL提高到4.85 U/mL，达优化前的2.36倍。由于目前国内尚无该菌的相关报道，因此，该菌株是高产壳聚糖酶的一个新菌种，可为高产菌株酶法降解壳聚糖的加工应用提供基础。

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