静息细胞降解叶黄素生产香味物质的条件优化

汪芳芳，孙建宏，叶建斌，马 科，毛多斌，杨雪鹏*

（1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001；2.山东中烟工业有限责任公司技术中心，山东 济南 250000）

静息细胞降解叶黄素生产香味物质的条件优化

汪芳芳1，孙建宏2，叶建斌1，马 科1，毛多斌1，杨雪鹏1*

（1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001；2.山东中烟工业有限责任公司技术中心，山东 济南 250000）

在单因素试验基础上，应用响应面设计对霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）A20的静息细胞降解叶黄素生产香味物质进行条件优化。确定最佳转化条件为：培养时间120 min，温度31.14℃，pH值为4.98，细胞浓度为17.64%，底物质量浓度为70 mg/L，此时叶黄素降解率为71.37%，与软件预测值71.54%相吻合，表明优化方案达到了预期效果，且具有良好的稳定性。对静息细胞降解叶黄素的发酵液中的主要成分进行气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，得到其主要产物为8-甲基-α-紫罗兰酮和3-氧化-α-紫罗兰酮。

静息细胞；叶黄素降解率；Box-Behnken设计；气相色谱-质谱联用

0 引言

叶黄素又名植物黄体素，是含氧类胡萝卜素的一种，两端成环。叶黄素在自然界中分布较广，富含于多种蔬菜 、花卉 、水果等植物中[1]。在一定条件下，叶黄素可以发生降解产生一系列香味物质，是重要的香料前体物[2]，因碳碳双键断裂位置的不同，可进一步转化形成多种重要的香味物质，如环氧紫罗兰酮、氢化异佛尔酮、茶香螺酮和二氢弥猴桃内酯等[3]，这些香味物质的阈值较低，具有一定的生物学意义和商业价值[4]。

目前关于叶黄素降解的报道主要有化学降解、物理降解和生物降解法[5]。生物法降解叶黄素由于其反应条件温和、专一性强、成本低、副产物少、分离纯化较容易等优点而受到人们的重视[6]。在前期工作中，主要是使用试验室筛选出的能高效降解叶黄素的菌株——霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）A20直接发酵叶黄素生产香味物质，然而这种生物降解方法为后期产香物质的提取增加了很大难度，因此作者利用霍氏肠杆菌A20的静息细胞作为催化剂，生物降解叶黄素。静息细胞转化是将菌体生长与产物形成过程分开，是以整个细胞作为反应催化剂,对外源底物进行修饰的生物转化[7]。它除具有正常细胞发酵法的优点外，还具有许多独特的优势：如可排除底物、产物对细胞生长的影响；可排除培养基中的成分对产物的干扰；可人为控制细胞与底物的加量；可有效地实现循环生物转化[8]。作者以霍氏肠杆菌静息细胞作为催化剂，研究其降解叶黄素的整体过程，为生物法高效降解叶黄素制备香味物质提供了一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

霍氏肠杆菌A20：前期筛选出的能高效降解叶黄素的菌株，本实验室保存。叶黄素标准品（纯度> 90%）：郑州利研有限公司。

叶黄素溶液用200 mg的叶黄素分散在2 g吐温80中，溶解在400 mL二氯甲烷中，将溶剂减压蒸出，溶解在10 mL乙醇中[9]。

种子培养基：蛋白胨10 g、酵母5 g、NaCI 1 g、蒸馏水1 L、pH=7.0。

发酵培养基：葡萄糖8 g、酵母10 g、蛋白胨5 g、K2HPO40.72 g、蒸馏水1 L、pH=7.0。

1.2 仪器与设备

恒温振荡器：上海福玛实验设备有限公司；1260 infinity液相色谱、气-质联用仪：美国安捷伦科技公司；GR85DA高压灭菌锅：致微仪器有限公司；高速冷冻离心机：德国Herolab公司。

1.3 方法

1.3.1 静息细胞的制备

挑选单菌落接种到种子液培养基中，放置于25℃、200 r/min的摇床中进行发酵培养，反应至菌液浓度测得OD600值为2～2.5时，得到种子液，放置在4℃冰箱中备用。将培养好的种子液按1.5%的接种量接入装液量为 100 mL的三角瓶中，在25℃、200 r/min条件下避光培养42 h后，在4℃、6 500 r/min下离心30 min，弃上清液，再用无菌生理盐水洗涤2遍，离心收集细胞使其悬浮于生理盐水中（V生理盐水:V原培养液=1∶20），放在 4℃下备用[10]。

1.3.2 叶黄素降解率测定方法

1.3.2.1 发酵液预处理方法

在避光条件下，将发酵液在4℃下6 500 r/min离心30 min，将离心后的上清液用二氯甲烷进行分离萃取，得到的萃取液加无水Na2SO4干燥过夜，再进行真空浓缩，蒸干溶剂后，再加2 mL甲醇，过0.45 μm的有机系膜，待HPLC分析，并用等体积不加静息细胞作为对照。

1.3.2.2 HPLC分析的条件

色谱柱选择C18柱（4.6 mm×250 mm，直径为5 μm），柱温为30℃，流动相为甲醇（体积比为1∶99），流速为0.6 mL/min，波长为460 nm，进样量为5 L。

1.3.2.3 叶黄素标准曲线的绘制

分别以甲醇配制20、40、80、120、160、200 mg/L的叶黄素标准溶液，根据建立的色谱条件进行HPLC分析后，以峰面积为纵坐标（Y），横坐标（X）代表质量浓度，制作出标准曲线。

式中：C试验为试验组中叶黄素的质量浓度，mg/L；

C对照为对照组中叶黄素的质量浓度，mg/L。

1.3.3 静息细胞的转化

将适量A20静息细胞悬液于不同pH值的0.1 mol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中，加入适量底物叶黄素溶液，100 mL摇瓶装液量为30 mL于不同温度下，150 r/min振荡培养不同时间，测定叶黄素降解率[11]。

1.3.4 响应面法优化转化工艺

根据单因素试验的结果，选择对叶黄素降解有显著影响的4个因素，即温度、pH值、细胞浓度、底物质量浓度为自变量，以叶黄素降解率为响应值，设计出四因素三水平的试验方案[12]，见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.5 静息细胞转化产物的鉴定

1.3.5.1 样品的处理

在避光的条件下，将发酵液进行离心、萃取、干燥、真空浓缩至1 mL后，过0.45 μm的有机系膜，进行GC-MS定性分析，并用等体积不加静息细胞作为对照。

1.3.5.2 GC-MS分析条件

气相条件：色谱柱：HP-5（30 m×0.25 mm；0.25 mm)；升温程序：初始温度45℃，保持5 min，以4℃/min升到110℃，保留5 min，以1℃/min升到150℃，保留5 min，以3℃/min升到200℃，以5℃/min升到280℃，保留5 min；进样口温度：270℃；传输线温度：270℃；分流比：1∶1；载气：He；流速：1 mL/min。

质谱条件：电离方式EI，电离电压70 eV；离子源温度230℃；质量扫描范围：30～550 amu。

2 结果与分析

2.1 叶黄素标准曲线的绘制

按照色谱条件测定，结果如图1所示。峰面积（Y）与浓度（X）的回归方程为 Y=43.135X+ 57.84，相关系数R2=0.997 6，表明在0～200 mg/L浓度范围内，叶黄素浓度与峰面积线性关系良好。

图1 叶黄素的标准曲线Fig.l Lutein standard curve

2.2 静息细胞降解叶黄素的单因素试验结果

2.2.1 培养温度对叶黄素降解率的影响

固定浓度为20%的静息细胞悬浮于pH为7.0的缓冲液中，添加60 mg/L叶黄素溶液，100 mL摇瓶装液量为30 mL于不同温度150 r/min振荡培养3 h，测定叶黄素降解率。结果如图2所示，当温度在20～30℃时，随着温度的升高，加速酶的产生，叶黄素降解率明显提高，达到了46.2%；当温度超过30℃后降解率明显降低，这可能是由于反应温度过高降低了酶的活性，故静息细胞的催化受到一定程度的限制[13]。因此，温度过高或者过低都不利于静息细胞降解叶黄素，故选择30℃较好。

图2 不同温度对叶黄素降解率的影响Fig.2 Effects of temperature on degradation rate of lutein

2.2.2 pH值对叶黄素降解率的影响

固定浓度为20%的静息细胞悬浮于不同pH值的缓冲液中，添加60 mg/L叶黄素溶液，100 mL摇瓶装液量为30 mL于30℃、150 r/min振荡培养3 h，测定叶黄素降解率。结果如图3所示，当pH值为5.0时，叶黄素的降解率最高达到60.8%。这表明静息细胞降解叶黄素的最适 pH值为 4.5～5.5，过酸或过碱环境都不利于酶的活性[14]。因此，选择的最适pH值为5.0。

图3 不同pH值对叶黄素降解率的影响Fig.3 Effects of pH value on degradation rate of lutein

2.2.3 细胞浓度对叶黄素降解率的影响

分别将不同浓度的静息细胞悬浮于pH值5.0的缓冲液中，添加60 mg/L叶黄素溶液，100 mL摇瓶装液量为30 mL于30℃、150 r/min振荡培养3 h，测定叶黄素降解率。结果如图4所示，细胞是降解叶黄素的酶系载体，其浓度直接决定着该酶系的酶活力和转化效果[15]。当细胞浓度达到15% 时，叶黄素降解率达到最高68.8%；此时继续增加细胞浓度，叶黄素降解率反而有所降低，这可能是由于过高的静息细胞浓度造成了细胞膜的破裂，影响了酶的活性，从而降低了叶黄素降解率[13]。因此，选择静息细胞浓度为15%。

图4 不同细胞浓度对叶黄素降解率的影响Fig.4 Effects of cell concentration on degradation rate of lutein

2.2.4 底物质量浓度对静息细胞转化的影响

固定浓度为15%的静息细胞悬浮于pH值5.0的缓冲液中，分别添加不同质量浓度叶黄素溶液，100 mL摇瓶装液量为30 mL，于30℃、150 r/min振荡培养3 h，测定叶黄素降解率。结果如图5所示，当叶黄素质量浓度低于80 mg/L时，随着叶黄素质量浓度的增加，叶黄素的降解量快速增加；此后继续增加叶黄素质量浓度时，叶黄素的降解量却有所下降，这可能是由于高质量浓度叶黄素对静息细胞中的酶活有底物抑制作用，从而导致叶黄素的降解量降低[11]。因此，选择叶黄素质量浓度为80 mg/L。

图5 不同底物质量浓度对叶黄素降解率的影响Fig.5 Effects of substrate concentration on degradation rate of lutein

2.2.5 时间对静息细胞转化的影响

固定浓度为15%的静息细胞悬浮于pH值5.0的缓冲液中，添加80 mg/L叶黄素溶液，100 mL摇瓶装液量为30 mL，于30℃、150 r/min振荡培养不同时间，测定叶黄素降解率。由图6可知，当反应时间为120 min时，叶黄素的降解率达到59.5%，之后随着反应时间的延长叶黄素的降解率达到平衡状态几乎不再增加。因此，选择反应时间为120 min。

图6 转化时间对叶黄素降解率的影响Fig.6 Effects of transformation time on degradation rate of lutein

2.3 静息细胞降解叶黄素的响应面试验结果

2.3.1 响应面试验设计与结果

在单因素试验的基础上，设计了四因素三水平的Box-Behnken响应面分析试验，进一步优化静息细胞转化条件，试验结果见表2。对表2数据进行多元二次回归拟合，得到回归模型方程为：

叶黄素降解率=-212.55+12.765A-88.284B-0.985C-51D-0.02AB+0.041AC+0.07AD+0.97BC+ 6.699BD-0.289CD-0.219A2-12.883B2-0.116C2-0.033D2。

对该回归方程进行方差分析和显著性检验，结果见表3。在试验设计范围内，回归模型非常显著（P<0.000 1），模型失拟项影响不显著（P=0.076 5> 0.05），决定系数R2=0.962，说明回归方程的拟合度较好，能够正确反映因变量与考察的自变量之间之间的关系；由F值判断，在选择范围内，这4个因素对叶黄素降解率的影响顺序为D>C>A>B。综上所述，使用该模型可以较好地对响应值（叶黄素降解率）进行分析和预测[16]。

2.3.2 响应曲面图分析

通过 Design Expert软件对4个因素分别两两交互，作出响应曲面，如图7所示。由图7可知，pH值与细胞浓度对叶黄素降解的交互作用最强。应用Design Expert软件得到叶黄素降解最优条件为温度31.14℃，pH值4.98，细胞浓度17.64%，底物质量浓度 70 mg/L，叶黄素降解率的预测值为71.54%。对优化后的最佳转化条件进行验证，平行试验3次，得到的叶黄素降解率平均为71.37%，与理论预测值基本吻合，说明该回归方程能比较真实地反映各因素对叶黄素降解率的影响，因此，使用该回归模型优化静息细胞降解叶黄素的培养条件是可行的。而初始培养条件得到的降解率为39.8%，说明优化后的降解率提高了79.32%。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.4 叶黄素降解产物的鉴定

对静息细胞降解叶黄素的发酵液中的主要成分进行GC-MS分析，结果如图8所示，叶黄素降解的主要产物为8-甲基-α-紫罗兰酮和3-氧化-α-紫罗兰酮。

根据GC-MS分析检测结果，对静息细胞降解叶黄素的降解路径进行推测，结果如图9所示。叶黄素在双加氧酶作用下，断裂9’-10’位得到3-羟基-α-紫罗兰酮，3-羟基-α-紫罗兰酮迅速氧化成3-氧化-α-紫罗兰酮。3-氧化-α-紫罗兰酮再经过转化得到8-甲基-α-紫罗兰酮，但具体的转化过程并不知晓，需要进行进一步研究。

表3 回归模型方差分析Table 3 ANOVA for regression model

图7 各因素交互作用对叶黄素降解影响的响应曲面Fig.7 Response surface plots of impacts of interaction effect of factors on degradation of lutein

图8 叶黄素降解产物GC-MS分析Fig.8 GC-MS chromatograms of degradation products of lutein

图9 叶黄素降解路径Fig.9 Biodegradation route of lutein

3 结论

通过单因素和响应面试验结合的方法对静息细胞降解叶黄素的转化条件进行优化，确定了最佳转化条件为：培养时间120 min，温度31.14℃，pH值为4.98，细胞浓度17.64%，底物质量浓度70 mg/L，最终得到叶黄素降解率为71.37%，比优化前提高了79.32%。叶黄素在静息细胞的作用下裂解产生8-甲基-α-紫罗兰酮和3-氧化-α-紫罗兰酮。

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OPTIMIZATION OF LUTEIN DEGRADATION PROCESS FOR PRODUCING AROMA COMPONENTS BY USING RESTING CELLS

WANG Fangfang1，SUN Jianhong2，YE Jianbin1，MA Ke1，MAO Duobin1，YANG Xuepeng1
(1.Food and Bioengineering College，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450001，China；2.Technology Center of Shandong China Tobacco Industry Co.，Ltd.，Jinan 250000，China)

Based on single factor experiments，the Box-Behnken response surface design was conducted to optimize the degradation conditions of lutein for producing aroma components by using resting cells of Enterobacter hormaechei A20.The optimized conditions were as follows:incubation time 120 min，temperature 31.14℃，pH 4.98，cell concentration 17.64%，and substrate concentration 70 mg/L.Under the optimum conditions，the degradation rate of lutein was up to 71.37%，consistent with the software prediction value 71.54%，which indicated that the optimized scheme reached the expected effect and had good stability.The main components in fermentation broth of lutein degraded by resting cells were detected by GC-MS，and were identified as 8-methyl-α-ionone and 3-oxo-α-ionone.

resting cells；degradation rate of lutein；Box-Behnken design；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS201.3

B

1673-2383(2017)01-0094-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170222.1117.036.html

网络出版时间：2017-2-22 11:17:11

2016-06-21

汪芳芳（1992—），女，安徽安庆人，硕士研究生，研究方向为食品科学与工程。

*通信作者