杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草酸的优化提取及含量测定

蒋永红，张晓峰，韩 萍，刘利娥，常正姣，王文宁

（郑州大学 公共卫生学院，河南 郑州 450001）

杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草酸的优化提取及含量测定

蒋永红，张晓峰，韩 萍*，刘利娥，常正姣，王文宁

（郑州大学 公共卫生学院，河南 郑州 450001）

在单因素试验基础上，采用响应面分析法优化杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草酸的水浴提取工艺条件，并使用酶标仪-分光光度法测定虫草酸含量。结果表明：最佳提取条件为液料比28∶1，浸提时间3 h,浸提温度35℃，虫草酸的含量为28.178 5 mg/g，RSD为0.81%。本研究表明该工艺条件可靠，测定方法可行。

杂粮蛹虫草菌丝共生体；虫草酸；响应面法；酶标仪-分光光度法

0 前言

虫草酸，又名D-甘露醇，是冬虫夏草和蛹虫草的一种主要活性成分，现已作为人工发酵虫草的质控指标之一。现代药理临床研究证明，虫草酸具有脱水、利尿、镇咳等作用。杂粮蛹虫草菌丝共生体是将杂粮经蛹虫草真菌生态转化进行成分重组的产物[1]，即以麦仁、糙米、大豆、奶粉为固体杂粮培养基，通过蛹虫草真菌生态转化得到的杂粮培养基和菌丝体共存的结构整体。本课题组现已完成杂粮蛹虫草菌丝共生体培养条件的工艺优化和部分成分的测定工作[2]，为检测菌丝共生体中虫草酸的含量，本试验优化了菌丝共生体中虫草酸的提取工艺，并采用简便、可行的酶标仪-分光光度法测定了菌丝共生体中虫草酸的含量，以期为杂粮蛹虫草菌丝共生体的综合开发利用提供依据。

探究提取菌丝共生体中虫草酸最优工艺条件是检测其虫草酸含量的前提。文献资料表明[3-4]，液料比、浸提时间、浸提温度对虫草酸提取量有较大影响，故本研究以这3个因素为优化条件，采用响应曲面分析法[5]，设计了Box-Behnken试验。目前用于虫草酸含量测定的方法有多种，如高效液相色谱法[6]、旋光法[7]、分光光度法[8]等，Xiao等[9]在2009年首次报告使用酶标仪-分光光度法测定药用虫草中的虫草酸含量，该方法具有高效、成本低、适合大批量测定等优点。此后文献中少见对该方法的重复验证。本研究使用酶标仪-分光光度法测定了菌丝共生体中虫草酸的含量，同时对其进行了严格的方法学考察。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杂粮蛹虫草菌丝共生体样品真空干燥至恒质量，使用高速万能粉碎机粉碎，过筛备用。

虫草酸标准品：上海源叶生物科技有限公司；L-鼠李糖：上海金穗生物科技有限公司；高碘酸钾、无水乙醇、醋酸铵、冰醋酸、乙酰丙酮、盐酸均为国产分析纯。

30%乙醇溶液、0.1%L-鼠李糖溶液、0.015 mol/L高碘酸钾溶液和Nash试剂（现用现配）。

1.2 仪器与设备

HH-42数显恒温磁力搅拌循环水箱、T6新世纪紫外可见分光光度计、101-2BS电热鼓风干燥箱：常州国华电器有限公司；L420台式低速离心机：湖南湘仪实验仪器开发有限公司；BioTeK荧光酶标仪：基因工程公司；85-1恒温磁力搅拌器；BCD-215KALM冰箱：青岛海尔股份责任有限公司；JT502N电子天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的制作

将质量浓度为100 mg/L的虫草酸标准溶液于350～500 nm范围内进行扫描，确定甘露醇的最大吸收波长。

取 1、2、3、4、5、6 mL虫草酸标准溶液于 10 mL容量瓶中，定容至刻度线，摇匀，得到质量浓度依次为10、20、30、40、50、60 mg/L的虫草酸溶液。分别加入1.00 mL 0.015 mol/L的高碘酸钾溶液，混匀，室温静置10 min，然后加入2.00 mL 0.1% L-鼠李糖溶液和4 mL Nash试剂，53℃恒温水浴15 min，室温冷却，用蒸馏水作空白对照，使用最大吸收波长测定吸光度。以质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制甘露醇标准曲线。

1.3.2 样品中虫草酸含量的测定

样品溶液制备：准确称取样品0.1 g，加入适量30%乙醇溶液水浴提取，浸提2次，在4 000 r/min的条件下离心15 min，合并两次的上清液，置于4℃冰箱中备用。

取样品液1.00 mL于洁净试管中，处理过程同标准曲线的制作过程，使用最大吸收波长测定吸光度。根据标准曲线回归方程计算样品虫草酸含量。

1.4 试验设计

1.4.1 单因素试验

考察液料比、浸提时间和浸提温度对杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草酸提取量的影响。液料比选择5∶1、15∶1、25∶1、35∶1、45∶1 5个水平，浸提时间选择1、1.5、2、2.5、3 h 5个水平，浸提温度选择20、30、40、50、60℃ 5个水平，分别进行单因素试验。

1.4.2 响应面试验设计

根据单因素试验结果，利用Box-Behnken中心组合试验设计原理，以虫草酸的提取量为指标，设计液料比（A）、浸提时间（B）和浸提温度（C）3个因素 3个水平中心组合试验，运用 Design-Expert 8.0.5.0软件进行响应面分析，建立三元二次回归方程预测模型并确定最佳的提取工艺参数，因子编码及水平设计见表1。

1.4.3 优化工艺验证试验

选取同一样品，称取3份各0.1 g，按照响应曲面法确定的最佳提取工艺参数制备虫草酸待测液，再按照1.3.2的方法测定虫草酸的含量，求其平均值，然后与响应曲面法所得的最优预测值进行比较，计算RSD（%）值。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.5 方法学考察

1.5.1 精密度试验

取同一样品，平行称取6份各 0.1 g，按照

1.3.2的方法测定虫草酸的含量。

1.5.2 稳定性试验

日内稳定性试验：取同一样品的虫草酸提取液，分别在0、2、4、10、14、24 h间隔内按照1.3.2的方法测定虫草酸的含量。

日间稳定性试验：取同一样品的虫草酸提取液，分别在1、2、3、4、6、8 d间隔内按照1.3.2的方法测定虫草酸的含量。

1.5.3 加标回收率试验

吸取虫草酸样品液9份，各1 mL，分别加入质量浓度为30、50、70 mg/L的标准品溶液0.5 mL，每组3份，编号为J1、J2、J3。按照1.3.2的方法测定虫草酸的含量。

2 结果与分析

2.1 虫草酸标准曲线的制作

100 mg/L的虫草酸标准溶液于 350～500 nm范围内进行紫外扫描，在414 nm处有最大吸收。虫草酸标准液在10～60 mg/L范围内，其吸光度与质量浓度有较好的线性关系（如图1所示），其线性回归方程为：y=0.005 0x-0.012 2，R=0.999 2。

图1 虫草酸标准曲线Fig.1 Standard curve of cordycepic acid

2.2 单因素试验结果

液料比、浸提时间、浸提温度对虫草酸提取量的影响如图2所示，随着液料比的不断增大，虫草酸提取量先升高后逐步趋于稳定。当液料比为35∶1时，虫草酸提取量达到小高峰为22.47 mg/g。随着浸提时间的延长，虫草酸提取量呈先升高后降低趋势，当浸提时间为2.5 h时，虫草酸含量达到最大，为23.36 mg/g。随着浸提温度的提高，虫草酸提取量呈现先升高后降低的趋势，之后趋于平稳，当浸提温度达到30℃时，虫草酸的提取量达到最大值，为26.76 mg/g。

图2 液料比、浸提时间和浸提温度对虫草酸提取量的影响Fig.2 Effect of liquid-to-material ratio,extraction duration,and extraction temperature on the yield of cordycepic acid

2.3 响应曲面法试验结果

2.3.1 回归模型的建立与分析

根据单因素的试验结果，确定了显著影响虫草素提取量的单因素水平。应用 Design-Expert 8.0.5.0软件，以虫草酸提取量为响应值，根据根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，设计了液料比（A）、浸提时间（B）和浸提温度（C）3个因素3个水平共17个试验点的响应面分析试验。设计方案及试验结果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 响应面试验结果Table 2 The results of response surface analysis

利用 Design-Expert 8.0.5.0软件进行自变量液料比（A）、浸提时间（B）和浸提温度（C）对菌丝共生体虫草酸提取量（mg/g）（Y）回归分析，建立三元二次多项回归方程:

由表3可知，本试验得出的二次回归模型具有极高的显著性（P<0.000 1），说明方程的拟合度良好，失拟项不显著（P=0.563 2），符合模型要求，可利用该模型分析最佳提取工艺条件。其校正决定系数为0.994 8，表明约有99.48%的虫草酸含量的变化可由此回归模型解释，相关系数为0.997 7，表明虫草酸含量的实测值与预测值之间具有较好的拟合度，可用于杂粮蛹虫草菌丝共生体虫草酸提取的分析和预测。

根据F值的大小可以判断3个因素对菌丝共生体虫草酸提取量的影响，其显著性顺序为B>C> A，即浸提时间>浸提温度>液料比；三因素间两两交互作用对虫草酸提取量的影响显著性顺序为：BC>AC>AB，交互作用的响应曲面如图3所示。综上单因素分析与多因素响应面分析可知，除一次项A达到显著水平（P<0.05），其他一次项和二次项都达到极高度显著水平（P<0.000 1），表明液料比、浸提时间、浸提温度3个因素对虫草酸提取量均具有显著影响。

表3 试验结果方差与分析Table 3 Variance analysis of test results

图3 交互作用对虫草酸含量影响的响应曲面Fig.3 Response surface plots of mutual action on the content of cordycepic acid

2.3.2 提取工艺优化及验证试验（表4）

利用软件对回归模型进一步分析，得到水浴法提取杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草酸的最佳提取工艺为液料比27.51∶1，浸提时间3 h，浸提温度35℃，实际操作中可将料液比设定为28∶1。在该工艺条件下虫草酸提取量的理论值为28.481 9 mg/ g。在此最优条件下进行3次平行验证试验，菌丝共生体中虫草酸的提取量平均值为28.178 5 mg/ g，与理论预测值相比，RSD=0.81%,表明多元回归方程具有良好的预测性，所选工艺条件重现性较好。

表4优化工艺验证试验结果（n=3）Table 4 Results of verification test of optimized process（n=3）

2.4 方法学考察结果

2.4.1 精密度

如表5所示，虫草酸含量测定精密度试验的RSD值为0.86%，表明精密度较好。

表5 精密度测试Fig.5 Tests of precision

2.4.2 稳定性

如表6和表7所示，在24 h和6 d内测定虫草酸含量的稳定性均较高，RSD值分别为1.65%、1.25%。

表6 稳定性测试（日内）Fig.6 Tests of Stability（intra-day） mg/g

表7 稳定性测试（日间）Fig.7 Test of stability(inter-day) mg/g

2.4.3 加标回收率

如表8所示，样品中虫草酸特异性较好，RSD值为0.59%。

表8 加标回收率测定Table 8 Determination results of recovery rate

3 讨论与结论

液料比对虫草酸的提取率有一定影响，提取液过少可能在达到饱和时仍然没有完全提取。邓黎等[10]研究认为液料比为50 mg/L时虫草酸提取率最大，与本研究进行二次提取所得结论相近。在模型的方差分析中，液料比对虫草酸提取量的影响并不十分显著，可能是因为本实验进行了两次提取，削弱了液料比这一因素对虫草酸的影响。浸提时间对体系中其他条件有一定的依赖性，多以整个体系的变化而变化，本研究显示在2～2.5 h期间虫草酸含量极速增加，这与肖建辉[11]、刘桂君等[12]研究认为浸提时间为2 h是虫草酸的提取量最高的结论有差异。在选择水浴提取条件中，李建平[13]研究得到的最佳浸提温度为90℃，刘桂君等[12]研究认为对菌丝体进行提取的最佳温度为60℃，对固体培养物进行提取时则为100℃，与本实验有较大差别。而Xiao等[9]研究得到的最佳浸提温度为40℃，与本研究结果较为接近。浸提温度低，可减少杂质溶出，但效率相对较低。而过高温度可能破坏游离成分结构。本试验以30%乙醇为提取剂，没有把浸提温度设置过高也是考虑到其对提取剂的影响。

在单因素试验基础上，通过Box-Behnken响应面分析法，建立了菌丝共生体中虫草酸提取工艺的三元二次回归方程，经检验，能够较好地预测菌丝共生体中虫草酸的提取量。响应面回归分析得到优化组合条件为：液料比28∶1，浸提时间3 h，浸提温度35℃。在该工艺条件下虫草酸提取量的理论值为28.481 9 mg/g。同时，本研究从方法学角度验证了酶标仪-分光光度法测定菌丝共生体中虫草酸含量的可靠性，为杂粮蛹虫草菌丝共生体中虫草酸含量的测定及其开发利用提供了理论依据。

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OPTIMIZED EXTRACTION AND CONTENT DETERMINATION OF CORDYCEPIC ACID FROM MULTIGRAIN CORDYCEPS MILITARIS HYPHASE SYMBIONTS

JIANG Yonghong，ZHANG Xiaofeng，HAN Ping，LIU Li’e，CHANG Zhengjiao，WANG Wenning
(College of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China)

The paper studied the optimization of water bath extraction process of cordycepic acid from Multigrain cordyceps militaris hyphase symbionts，as well as the feasibility of using microplate reader-UVS to determine the content of cordycepic acid.Based on three single factor experiments，the extraction process was optimized by response surface analysis;and the content of cordycepic acid was determined by microplate reader-UVS.Results showed that the optimum extraction conditions were as follows:liquid-to-material ratio 28∶1，extraction duration 3 hours，and extraction temperature 35℃.Under the optimum conditions，the content of cordycepic acid was up to 28.178 5 mg/g，with RSD of 0.81%.This study proved the process was reliable and the determination method was feasible.

Multigrain cordyceps militaris hyphase symbionts；cordycepic acid；response durface analysis；microplate reader-UVS

TS201.2

B

1673-2383(2017)01-0088-06

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170222.1117.034.html

网络出版时间：2017-2-22 11:17:07

2016-05-06

蒋永红（1990—），女，河北邯郸人，硕士研究生，研究方向为营养与相关疾病。

*通信作者