全自动固相萃取-高效液相串联质谱测定分析水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物

徐潇颖，刘 柱，梁晶晶，陈万勤，罗金文

（浙江省食品药品检验研究院，浙江 杭州 310052）

全自动固相萃取-高效液相串联质谱测定分析水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物

徐潇颖，刘 柱，梁晶晶，陈万勤，罗金文*

（浙江省食品药品检验研究院，浙江 杭州 310052）

建立水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物的全自动固相萃取-高效液相串联质谱检测方法，采用全自动固相萃取仪代替传统的净化方式，使前处理操作具有简单、快速、重现性好的优点。并对目前研究中常见的3种定量分析方法进行比较，发现采用同位素内标法在0.1～10 ng/mL线性范围内对孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫进行定量分析，相关系数均大于0.999；在空白样品中进行0.5、1.5、4.0 μg/kg 3组不同水平的加标试验，平均回收率在88.8%～103.5%之间，相对标准偏差RSD（n=6）在1.32%～3.62%之间。相比于外标法和双同位素内标定量法，此方法结果准确、重现性佳，更适合水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物的残留测定分析。

孔雀石绿；结晶紫；隐色结晶紫；隐色孔雀石绿；同位素内标；全自动固相萃取

0 引言

孔雀石绿（MG）和结晶紫（CV）是人工合成的三苯甲烷类碱性工业染料，最早被应用于纺织工业，后因其抗菌效果好、价格低廉被广泛应用于水产养殖业中[1-4]。三苯甲烷类化合物具有高毒、高残留和三致（致癌、致畸、致突变）等危害，而且孔雀石绿（MG）和结晶紫（CV）经生物体代谢后会产生危害性更强的隐色孔雀石绿（LMG）和隐色结晶紫（LCV）[5]。因而欧盟、美国FDA等宣布禁止其在水产品养殖过程中使用[6-7]。2005年欧盟在我国出口水产品中检出三苯甲烷类药物残留，给我国水产品出口带来不利影响[8]。所以，为满足进出口检测要求，确保水产品的安全性，建立准确可靠的定量定性方法迫在眉睫。

目前，国内外对孔雀石绿、结晶紫和其代谢产物的检测方法主要有酶联免疫法[9]、分光光度法[10]、高效液相色谱法（HPLC）[11-12]、液相色谱-质谱法（LC-MS）[13-14]和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/ MS）[15-17]。酶免疫法一般用于大批量用品的快速筛选；分光光度法由于灵敏度不高，准确性差，在复杂样品基质中应用较少；液相色谱法无法将孔雀石绿、结晶紫和它们的代谢产物进行分别定量，需通过PbO2氧化柱，将隐色孔雀石绿和隐色结晶紫转化为其对应物质后再进行测定，因而无法实现孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物的同时测定；液相色谱-质谱法虽能满足定性要求，但在定量检测中准确度方面仍有欠缺；液相色谱-串联质谱法具备灵敏度高、特异性强等优点逐渐成为孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物测定的主流方法，但对于检测结果采用外标法、内标法还是按GB/T 19857—2005的方式进行定量，目前还未见综合比较分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲈鱼：市售。

孔雀石绿（MG）、结晶紫（CV）、隐色孔雀石绿（LMG）、隐色结晶紫（LCV）购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，它们分别对应的同位素内标购自WITEGA（纯度均大于98%）。

标准储备溶液的配制：准确称取MG、CV、LMG、LCV、D5-MG、D6-LMG、D6-CV与D6-LCV标准品，用乙腈溶解并稀释成100 μg/mL的标准储备液，-18℃避光保存条件下可稳定3个月；乙腈、甲醇为色谱醇（Merck试剂）；试验用水为Millipore超纯水；其他试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

Milli-Q Gradient超纯水仪：法国 Millipore；Fotector plus全自动固相萃取仪：美国Reeko；台式离心机：美国Thermo Fisher；快速多样品自动匀浆机：美国 Pro Scientific；液相色谱仪：日本 Shimadzu；三重四级杆串联质谱仪：美国 SCIEX。

1.3 样品处理

1.3.1 提取

3.5 宣传推介，拓宽销路 积极运作，尽快注册“彬州梨”地理标志证明商标；参加各类展会并在上海、广州等城市举办彬州梨专题推介会；邀请农林卫视、咸阳电视台等来彬拍摄 “彬州梨”专题节目，在网络、电视和其他新媒体上推介宣传，重塑“彬州梨”品牌形象；利用彬州梨走上湖南卫视“天天向上”栏目的良好效应，整合现有彬州梨网络销售渠道，与中国邮政等快递公司深度合作，统一标准、统一货源、统一销售，让彬州梨走向全国。

精确称取5.0 g（精确至0.000 1 g）已混匀的样品于50 mL离心管中，加入混合同位素内标工作液，加入8 mL乙腈，超声振荡提取2 min，8 000 r/min匀浆提取30 s，4 000 r/min离心5 min，转移上清液移至25 mL比色管中；用玻棒捣碎离心管中的沉淀，8 mL乙腈重复提取1次，上清液合并至25 mL比色管中，用乙腈定容至25.0 mL，摇匀备用。

1.3.2 净化

精确移取2.0 mL样品溶液加至已活化（使用前用5 mL乙腈活化）的中性氧化铝柱上，3 mL乙腈洗脱两次，收集洗脱液于10 mL试管中，35℃下氮气吹至近干，加入2.0 mL初始流动相，漩涡溶解复溶，0.22 μm微孔滤膜过滤后转移至样品瓶中用于LC-MS/MS分析。

1.4 液相色谱串联质谱分析

1.4.1 液相色谱条件

表1 色谱分离梯度洗脱程序Table 1 Chromatographic gradient elution program

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源，正离子扫描；扫描方式：多重反应监测；电离电压：5 500 V；离子源温度：500℃；气帘气流速：30 L/min；碰撞气流量：5 L/min；电源 ；化合物定性离子对、定量离子对、锥孔电压、碰撞能量见表2。

表2 质谱参数Table 2 MS parameters

2 结果与分析

2.1 样品处理条件的优化

在前处理过程中，采用乙腈进行提取，由于样品基质较复杂，因此需采用中性氧化铝柱对提取液进行净化，除去一些与被测组分相似的干扰物和色素等杂质。在净化过程中，对回收率与乙腈洗脱次数之间的关系进行研究，结果如图1所示，表明孔雀石绿、结晶紫和它们的代谢产物随洗脱次数的增加回收率呈上升趋势，但二次洗脱后，回收率数值差异较小，基于试验效率及研究成本的考虑，采用2次洗脱。

图1 4种组分在中性氧化铝柱上的洗脱曲线Fig.1 Elution curves of 4 components on Alumina-N column

传统的过柱净化过程存在效率低、过柱流速不易控制以及操作过程易引起人为误差，因此本试验采用全自动固相萃取仪进行净化富集，进行智能软件设定后，可同时自动完成多样品的净化富集，大大缩短了前处理时间，有效提高检测精度和检测效率，净化程序见表3。

按照本实验优化后的洗脱程序对3组不同规格的中性氧化铝柱进行选择，结果见表4，发现不同柱填充量引起了孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物的回收率差异，故选用1 cc/30 mg的中性氧化铝进行净化。

表3 全自动固相萃取仪洗脱条件Table 3 Elution parameters of all automatic solid phase extraction apparatus

表4 不同规格中性氧化铝柱回收率结果Table 4 Recovery rates of Alumina-N columns with different specifications

2.2 色谱分离条件的选择

分别选用甲醇、乙腈作为流动相的有机相，实验发现孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物具有较强的非极性，在洗脱过程中出现不同程度拖尾现象，故采用乙腈作为有机相分离效果更好。将水相中5 mmol/L乙酸铵浓度配制为10 mmol/L可增加被测定组分的离子化效率，提高相应灵敏度。同时本试验采用梯度洗脱减少基质影响。

选用Waters Atlantis T3柱（150 mm×2.1 mm，5.0 μm）进行分离，能有效地在5 min内完成4种化合物的分离，且5.0 μm的内径可以减少拖尾现象，使峰形具有更好的对称性。

2.3 孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿、隐色结晶紫及对应内标物的标准溶液离子色谱图

采用试验优化条件后，孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物（10 ng/mL）的标准溶液离子色谱图如图2所示；同位素内标D5-MG、D6-LMG、D6-CV与D6-LCV的标准溶液离子色谱图如图3所示。

2.4 3种不同定量方式的标准曲线的绘制及回收率结果

图2 混合标准样品的离子色谱图Fig.2 Quantitative ion chromatograms of mixed standards

图3 孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物的仪器信噪比（加标量0.1 μg/kg）Fig.3 Signal-to-noise ratio of 4 components

在进行样品前处理条件优化过程中，发现孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物在净化过程中的回收率存在一定差异，因此在配制标准曲线时采用基质加标的方式，称取样品后加入适量的混合标准储备液和混合内标标准溶液，进行提取净化后至质量浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、8.0、10.0 ng/mL的系列工作液，以仪器响应的峰面积Y对应质量浓度X（ng/mL）进行线性回归，分别采用外标法、内标法以及GB/T 19857—2005的方式进行定量分析，回归方程及相关系数见表5，结果表明当采用外标法进行定量分析时，孔雀石绿的相关系数偏低；GB/T 19857—2005法中结晶紫以氘代孔雀石绿，隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿进行定量，由于结晶紫与孔雀石绿的分子结构上存在一定差异，导致过柱回收率有所差别，因此采用以氘代孔雀石绿对结晶紫进行定量分析造成相关系数较低；当采用内标法进行定量时4种被测物质的线性关系良好，相关系数R2≥0.999。

选取不含待测物的空白鱼肉样品为基质，进行0.5、1.5、4.0 μg/kg 3个水平的标准添加回收试验，每个水平进行6次重复试验，采用外标法、内标法以及GB/T 19857—2005的方式进行定量分析，回收率和精密度数据见表6。结果表明，外标法测定中孔雀石绿精密度差，回收率不稳定；而结晶紫在采用外标法及GB/T 19857—2005法进行定量分析过程中都存在回收率低的现象；隐色孔雀石绿和隐色结晶紫在采用不同方法定量时，具有较好的回收率，精密度较高，该现象与两者较为稳定的化学性质有关。3种不同的定量方法中，内标法对孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿、隐色结晶紫的平均加标回收率分别在88.8%～90.5%、99.5%～ 100.5%、96.8%～103.5%、97.7%～100.6%之间，相对标准偏差均小于3.62%。说明本方法准确度高、重复性好。

表5 3种不同定量方式的标准曲线及相关系数Table 5 Standard curves and correlation factions of three different quantitative methods

表6 3种不同定量方式的计算不同加标水平的回收率（n=6）Table 6 Recovery rates and RSD of fortified samples by three different quantitative methods(n=6)

2.5 方法检出限试验

通过在阴性样品中添加标准物质的方法考察灵敏度。在规定的取样质量下，定容体积为1.0 mL，按照3倍信噪比计，MG、CV、LMG、LCV的检出限均为0.1 μg/kg；当在被测样品中添加水平为0.1 μg/kg时，信噪比均大于3，表明孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物均可达到检出限，如图3所示。

3 结论

本试验采用全自动固相萃取仪代替传统的过柱净化，大大提高了前处理效率，实现过柱流速可控性，大幅减少了操作过程中引起的误差。在此基础上，分别采用外标法、内标法以及GB/T 19857—2005法对孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物进行定量分析，发现采用外标法时，孔雀石绿在不同加标水平的回收率大于110%，且相对标准偏差在8.6% ～10.2%之间，精密度较差；而GB/T 19857—2005法中采用氘代孔雀石绿对结晶紫进行定量，由于结晶紫与孔雀石绿在分子结构上的存在差异，过柱净化过程中回收率不同，所以该法中结晶紫的不同水平加标回收率在73.6%～76.4%之间，相对标准偏差均大于5%；当采用内标法时，可有效避免因操作过程中待测物质的损失而造成回收率偏低的现象，消除机制对测定结果的影响，3组不同水平的加标试验，平均回收率在88.8%～103.5%之间，相对标准偏差在1.32%～3.62%范围内，达到了结果准确可靠、回收率稳定、精密度好的实验目标。

图3 孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿、隐色结晶紫的同位素内标离子色谱图Fig 3.Quantitative ion chromatograms of isotope internal standards

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DETERMINATION AND ANALYSIS OF MALACHITE GREEN，CRYSTAL VIOLET AND THEIR METABOLITES RESIDUES IN AQUATIC PRODUCTS BY SPE-LC-MS/MS

XU Xiaoying，LIU Zhu，LIANG Jingjing，CHEN Wanqin，LUO Jinwen
（Zhejiang Institute for Food and Drug Control，Hangzhou 310052，China）

Malachite green(MG)and crystal violet(CV)are the synthetic triphenylmethane basic dyes，which are the compounds with high toxicity，high residue and carcinogenic，teratogenic，mutagenic and other hazards.An automatic-SPE-LC-MS/MS method was established for simultaneous determination of malachite green，crystal violet and their metabolites residues in aquatic products in the present study.Instead of traditional method of purifying，automatic solid phase extraction(SPE)enabled the pretreatment process had the advantages of rapid，accurate and good reproducibility.Meanwhile，three common quantitative analytical methods were also compared. The results showed that good linear relationships were obtained in the range of 0.1～10.0 ng/mL for malachite green，crystal violet and their metabolites analysis using isotope internal standard method and the correlation coefficients R2were all higher than 0.999.The average recovery rates of blank samples were from 88.8%to 103.5%with the standard levels of 0.5，1.5 and 4.0 μg/kg and the relative standard deviations(RSD)were varied from 1.32%to 3.62%（n=6）.Compared with external standard method and two-isotopic standard method，this method showed good repeatability and accuracy and was more suitable for the analysis of malachite green，crystal violet and their metabolites residues.

malachite green；crystal violet；leucomalachite green；leucocrystal violet；isotope internal standard；automatic-SPE

TS201.2

B

1673-2383(2017)01-0081-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170222.1117.032.html

网络出版时间：2017-2-22 11:17:04

2016-05-06

浙江省科技计划项目（2015C37054）；浙江省科技厅重大项目（2014C02001）

徐潇颖（1989—），女，浙江金华人，助工，研究方向为食品安全与分析技术。

*通信作者