酸性离子树脂催化咖啡酸辛酯的合成及其抗氧化活性研究

侯凡一，刘 伟，王 芳

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

酸性离子树脂催化咖啡酸辛酯的合成及其抗氧化活性研究

侯凡一，刘 伟*，王 芳

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

为改善天然酚酸在油脂体系中的溶解性，常采用酯化手段提高其亲酯性。以咖啡酸和辛醇为原料、酸性离子树脂为催化剂，在不加入其他溶剂的情况下，酯化合成咖啡酸辛酯，得到的最优反应条件为咖啡酸0.25 mmol、辛醇2 mL、酸性离子树脂Amberlyst35用量5%、反应温度100℃、反应时间6 h，咖啡酸辛酯的产率是（98.18±0.83）%。在对[DPPH·]自由基清除能力的试验中，咖啡酸经亲脂化改性后能有效地保持其抗氧化活性；在对β-胡萝卜素保护能力的试验中，咖啡酸经亲脂化改性后其抗氧化活性得到明显提高。

咖啡酸辛酯；酯化；亲脂化改性；抗氧化活性

0 引言

咖啡酸（caffeic acid，CA）化学名为 3,4-二羟基肉桂酸，是一种天然存在的酚酸类抗氧化剂，分布于水果、蔬菜、葡萄酒、橄榄油和咖啡中[1]，并且表现出广泛的生物活性，如抗菌[2]、抗肿瘤[3]和抗氧化活性[4]。然而，咖啡酸在常见油脂体系中的溶解度很低，限制了其应用。将亲水性的咖啡酸与脂肪族化合物分子（如脂肪醇）进行酯化反应，可以改变其溶解性，扩大其在食品工业以及日用化学品工业中的应用范围[5]。此外，与咖啡酸相比，咖啡酸酯（如咖啡酸苯乙酯）有更明显的生物功能，如抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤[6]和调节血脂[7]。尽管咖啡酸酯可以从Piper sanguineispicum树叶等植物来源中提取，但是其含量少且需要多步纯化，成本高昂，因此研究高效的咖啡酸酯合成方法显得尤为重要。

Fiuza等[8]采用 Fischer酯化，硫酸作催化剂合成了咖啡酸丙酯，然而强酸催化合成的主要缺点在于环境污染，并且腐蚀设备进而增加生产成本。Chen等[5]研究了Novozym435酶催化咖啡酸和辛醇反应合成咖啡酸辛酯，反应 55 h后转化率达90.34%，但酶催化耗费时间长，效率低，且高温条件下酶易失活。S尴rensen等[9]对咖啡酸衍生物的抗氧化构效关系进行了研究，发现咖啡酸辛酯和十二烷基酯表现出更高的抗氧化活性。

离子交换树脂是一种不溶于水、酸和碱的高分子电解质，虽不溶于酸或碱，却具有酸碱的性能并且价廉易得，且对设备没有腐蚀，也不会污染环境和引起副反应。离子交换树脂主要以两种方式应用于酯化催化：一种是利用离子交换树脂本身作为催化剂；另一种是将常用的催化剂负载于树脂上，以此作为合成催化剂[10]。从理论上讲，目前几乎所有用H2SO4等催化的酯化反应，均可用强酸性阳离子交换树脂代替[11]。目前研究发现，在离子交换树脂酯化反应中，A-35、NKC-9、A-15和IR120H使用较多，催化效率较高。作者以咖啡酸和辛醇为原料，以酸性离子树脂为催化剂，考察不同的树脂种类及催化剂用量、溶剂的种类、反应温度、反应时间、底物比等对咖啡酸的转化率和咖啡酸辛酯产率的影响，从而得到合成咖啡酸辛酯的最优反应条件。并且通过对[DPPH·]自由基清除能力的测定和β-胡萝卜素保护试验这两种抗氧化活性测定方法，比较咖啡酸辛酯、TBHQ和咖啡酸的抗氧化活性的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

咖啡酸（纯度＞98.0%）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；辛醇（纯度＞99.5%）：阿法埃莎（天津）化学有限公司；酸性离子树脂：南大合成化学有限公司；甲醇：色谱纯，美国生物VBS天津景隆元科技发展有限公司。

1.2 主要仪器设备

e2695高效液相色谱仪（HPLC）：沃特世科技有限公司（Waters，美国）；BSA224S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；IKA型恒温磁力搅拌器、旋转蒸发仪：艾卡（广州）仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 合成方法

在15 mL反应管中依次加入咖啡酸45.0 mg、一定量的酸性离子树脂Amberlyst35（简称A-35）、辛醇3 mL，并加入磁力搅拌子。将反应管置于恒温磁力搅拌器于一定温度下，900 r/min进行反应，反应时间6 h。

1.3.2 产品纯化及定量

取10 μL反应后的混合体系，溶于10 mL容量瓶中，用色谱级甲醇定容，并用45 μm微孔滤膜过滤，待液相分析。对符合要求（转化率≥95%）的反应体系，用乙酸乙酯提取，并进行水洗、干燥，然后脱去溶剂及辛醇。将剩余的物质进行柱层析纯化。建立咖啡酸与咖啡酸辛酯的标准曲线，计算转化率及产率。

1.3.3 咖啡酸辛酯抗氧化活性的测定

称取制备的咖啡酸辛酯14.6 mg于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，制得母液即1 000 μmol/L。然后用甲醇逐级稀释制备浓度分别为10、50、100、200、500 μmol/L的样品溶液，用于抗氧化活性测定。咖啡酸和TBHQ不同浓度的溶液制备方法同上。

1.3.3.1 对[DPPH·]清除能力的测定

测定方法参考文献[12-13]，取洁净试管，加入4 mL 0.1 mmol/L的[DPPH·]甲醇溶液和800 μL不同浓度的TBHQ、咖啡酸和咖啡酸辛酯待测溶液。然后在常温下反应55 min后，用紫外可见分光光度计在520 nm处测定体系的吸光度As，并做平行试验。以甲醇为空白代替样品，进行重复试验，测得吸光度Ab。以甲醇代替[DPPH·]甲醇溶液，进行重复试验测定吸光度A0。

式中：As为测试样品添加到[DPPH·]甲醇溶液中反应后测定的吸光度；A0为样品在未加[DPPH·]的甲醇溶液中的吸光度；Ab为未添样品的[DPPH·]的甲醇溶液的吸光度。

1.3.3.2 β-胡萝卜素保护试验

测定方法参考文献[14]，取1.0 mg的β-胡萝卜素、20 μL亚油酸和200 μL Tween40溶于20 mL氯仿中，充分混匀。除去氯仿后，加入200 mL的饱和溶氧水制得混合乳状液。取洁净的10 mL的具塞试管，加入10 mL乳状液和400 μL的不同浓度的TBHQ、咖啡酸和咖啡酸辛酯待测溶液。在波长470 nm下进行吸光度的测定。剩余的混合溶液于50℃下保温60 min后，同样在波长470 nm下进行吸光度的测定。以甲醇溶液代替样品溶液，重复试验，在波长470 nm处测定其吸光度值A0和A60。

式中：A0为空白对照液0 min的吸光度；A60空白对照液60 min的吸光度；为加入样品的混合液0 min的吸光度；为加入样品的混合液60 min的吸光度。

1.4 分析方法

色谱柱：Symmetry Shield TM 柱 （4.6×150 mm，3.5 μm）；流速：0.8 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30℃。采用等度洗脱，流动相体系 B相为0.5%乙酸水，C相为甲醇，其体积比为 20∶80，紫外检测波长为 325 nm。

2 结果与方法

2.1溶剂的种类对咖啡酸辛酯合成的影响

反应体系中是否添加溶剂以及溶剂的种类对合成反应的产率和转化率有重要影响。本研究对比无溶剂及添加溶剂体系，在无溶剂体系中，以辛醇作为溶剂的同时也作为反应底物；在溶剂体系中，对比四氢呋喃、二甲基四氢呋喃、乙二醇二甲醚3种溶剂对合成反应的转化率及产率的影响。本试验咖啡酸辛酯合成的酯化反应条件是：咖啡酸0.25 mmol，辛醇3 mL，A-35离子树脂127.4 mg（底物质量的5%），反应温度100℃，反应时间6 h，考察了溶剂对咖啡酸辛酯合成反应的影响，结果如图1所示。

图1 溶剂的种类对咖啡酸辛酯产率和咖啡酸转化率的影响Fig.1 Effect of solvent on octyl caffeate yield and CA conversion

由图1可知，在溶剂体系中，四氢呋喃作为酯化合成反应常用的溶剂，产率不足10%，二甲基四氢呋喃、乙二醇二甲醚作为类似的醚类溶剂，沸点66～85℃，需要耐高压反应装置，另外价格较高，并且反应的产率低。由图1可知，3种溶剂体系转化率显著高于产率，说明溶剂体系可能有副产物生成，故不选用溶剂体系。在无溶剂体系中，咖啡酸辛酯的产率和咖啡酸的转化率是最高的。综合考虑，选择无溶剂体系作为合成反应的条件。

2.2 催化剂的种类对咖啡酸辛酯合成的影响

催化剂通过降低反应的活化能来加快反应速度，有效地提高反应的转化率和产率。离子交换树脂作为一种新型环保的绿色催化剂被越来越多地使用在酯化反应工艺中。尤其是 A-15、A-35、NKC-9、IR-120H等被使用较多，效果较好。本试验反应条件为咖啡酸0.25 mmol，辛醇3 mL，酸性离子树脂127.4 mg（底物质量的5%），反应温度100℃，反应时间6 h，考察4种不同的催化剂（A-15，A-35，NKC-9，IR-120H）对咖啡酸辛酯合成反应的影响，结果如图2所示。

由图2可知，使用A-35酸性离子树脂催化合成咖啡酸辛酯的产率达（98.16±0.83）%，咖啡酸的转化率达（98.82±0.00）%，均为最大值。而NKC-9、A-15、IR-120H所催化合成咖啡酸辛酯的产率及咖啡酸的转化率都低于A-35。因此，选择A-35酸性离子树脂作为合成反应的催化剂。

图2 催化剂的种类对咖啡酸辛酯产率和咖啡酸转化率的影响Fig.2 Effect of catalyst types on octyl caffeate yield and CA conversion

2.3 催化剂用量对咖啡酸辛酯合成的影响

催化剂是影响化学反应速率的重要因素。当其他条件不变时，催化剂用量能改变化学反应所需的时间。本试验反应条件为咖啡酸0.25 mmol，辛醇3 mL，反应温度100℃，反应时间6 h，考察了催化剂酸性离子树脂A-35的用量（底物质量的1.0%，2.5%，5.0%，7.5%，10%）对咖啡酸辛酯合成反应的影响，结果如图3所示。

由图3可知，当催化剂的用量从1.0%升至5.0%，咖啡酸辛酯的产率和咖啡酸的转化率也在一直增加，分别由（58.33±1.52）%升到（98.18± 0.83）%和由（58.72±1.02）%升到（98.84±0.02）%；当催化剂的用量从5.0%升至10.0%时，咖啡酸辛酯的产率和咖啡酸的转化率随着催化剂的用量增加分别从（98.18±0.83）%到（98.85±0.11）%和（98.84±0.02）%到（99.30±0.00）%，变化不大，说明催化剂已经达到饱和，再增加催化剂的用量已无意义。若再多加入A-35，产率及转化率提高不显著。综合考虑，选择催化剂的用量为5.0%。

2.4 底物添加量对咖啡酸辛酯合成的影响

在无氮气保护条件下，咖啡酸0.25 mmol，酸性离子树脂A-35用量127.4 mg，反应温度100℃，反应时间6 h，考察了底物添加量（1～5 mL）对咖啡酸辛酯合成反应的影响，结果如图4所示。

由图4可知，当底物的添加量由1 mL升至2 mL时，咖啡酸辛酯的产率和咖啡酸的转化率随着底物添加量的增加而增加，即分别由（91.33± 1.77）%升到（98.40±0.83）%和（97.00±0.04）%达（98.91±0.02）%；当底物的添加量由2 mL升至5 mL时，咖啡酸辛酯的产率和咖啡酸的转化率随着底物添加量的增加，分别从（98.40±0.83）%到（98.29±0.03）%和（98.91±0.02）%变化至（98.33± 0.00）%，基本保持不变。综合考虑，选择咖啡酸辛酯的合成反应的底物添加量为2 mL。

2.5 反应时间和反应温度对咖啡酸辛酯合成的影响

在无氮气保护条件下，咖啡酸0.25 mmol，辛醇2 mL，酸性离子树脂A-35用量85.7 mg，反应温度100℃，采用取样试验，取样时间0.25～8 h，考察了反应时间和反应温度对咖啡酸辛酯合成反应的影响，结果如图5、图6所示。

由图5和图6可知，在80℃和90℃下，咖啡酸辛酯的产率和咖啡酸的转化率随着时间的延长而增加，8 h还未达到平衡。在100℃下，咖啡酸辛酯的产率和咖啡酸的转化率随着时间的延长而增加，即分别从（14.84±0.67）%（0.25 h）增加至（98.16±0.60）%（6 h）和（14.96±3.42）%（0.25 h）增加至（98.84±0.14）%（6 h），再延长时间，咖啡酸辛酯的产率和咖啡酸的转化率基本不变，说明6 h以后反应已经达到平衡状态。同理可得，在110℃时，咖啡酸辛酯的产率和咖啡酸的转化率在3 h达到最大，3 h以后基本保持不变，说明110℃下反应3 h达到平衡状态。在120℃条件下，咖啡酸辛酯的产率和咖啡酸的转化率在2 h达到最大，2 h以后基本保持不变，说明120℃条件下2 h反应达到平衡状态。综合考虑，由于酸性离子树脂的耐受温度低于120℃，在较高温度下易生成副产物，且达到高温成本及代价更高，鉴于实际考虑，选择100℃作为咖啡酸辛酯的合成温度，反应时间为6 h。

图5 不同温度条件下咖啡酸辛酯产率随取样时间的变化Fig.5 Changes of octyl caffeate yield at the different sampling time under different temperatures

图6 不同温度条件下咖啡酸转化率随取样时间的变化Fig.6 Changes of CA conversion,at the different sampling time under different temperatures

2.6 抗氧化活性测定结果

2.6.1 咖啡酸辛酯对[DPPH·]自由基的清除能力

由图7可知，咖啡酸和咖啡酸辛酯在浓度10～ 50 μmol/L范围内对[DPPH·]清除率线性较好，成量效关系；在浓度100～1 000 μmol/L范围内，清除率均基本不再增大，达到饱和，最大分别可达（95.70±0.08）%和（92.60±0.12）%。TBHQ在浓度10～200 μmol/L范围内对 [DPPH·]清除率线性较好，成量效关系；在浓度500～1 000 μmol/L范围内，清除率不再增大，达到饱和。另外，当浓度低于500 μmol/L时，TBHQ对[DPPH·]清除率低于咖啡酸和咖啡酸辛酯对[DPPH·]清除率，而咖啡酸和咖啡酸辛酯对[DPPH·]清除率能力相当，说明在评价对[DPPH·]自由基清除能力的试验时，咖啡酸和咖啡酸辛酯的抗氧化活性优于TBHQ，咖啡酸经亲脂化改性后能有效地保持其抗氧化活性。

图7 咖啡酸辛酯对[DPPH·]自由基的清除作用Fig.7 [DPPH·]scavenging activity of octyl caffeate

2.6.2 咖啡酸辛酯对β-胡萝卜素的保护能力

由图 8可知，咖啡酸辛酯在浓度 10～100 μmol/L范围内对β-胡萝卜素的保护比随着浓度的增大而增大，线性较好，成量效关系；在浓度200～ 1 000 μmol/L范围内，对β-胡萝卜素的保护比增长缓慢，最大可达（87.76±2.56）%。TBHQ在浓度50～500 μmol/L范围内对β-胡萝卜素的保护比随着浓度的增大而增大，线性较好，成量效关系；在浓度500～1 000 μmol/L范围内，对β-胡萝卜素的保护比继续增长，最高可达（67.61±0.51）%。然而，咖啡酸在浓度10～100 μmol/L范围内对β-胡萝卜素的保护比都随着浓度的增大而呈现减小的趋势，即从（8.67±1.39）%降至(-9.82±1.16)%，反而表现出促氧化作用。咖啡酸辛酯对β-胡萝卜素的保护比高于TBHQ，且远大于咖啡酸，可以说明在对β-胡萝卜素保护能力的测定试验中，咖啡酸经过酯化改性后得到的产物对β-胡萝卜素保护能力得到显著提高。

图8 咖啡酸辛酯对β-胡萝卜素保护能力Fig.8 β-carotene protection ability of octyl caffeate

3 结论

（1）综合考虑，咖啡酸辛酯的合成条件选择为：咖啡酸0.25 mmol、辛醇2 mL、酸性离子树脂A-35用量5%、反应温度100℃、反应时间6 h，咖啡酸辛酯的产率达（98.18±0.83）%。

（2）在对[DPPH·]自由基清除能力的测定中，咖啡酸和咖啡酸辛酯的抗氧化活性相当，说明咖啡酸经亲脂化改性后能有效地保持其抗氧化活性。

（3）在对β-胡萝卜素保护能力的测定中，咖啡酸辛酯的抗氧化活性远远高于咖啡酸，说明咖啡酸经过酯化改性后得到的产物对β-胡萝卜素的保护能力得到显著提高。

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SYNTHESIS OF OCTYL CAFFEATE USING ACIDIC ION RESIN AS CATALYST AND ITS ANTIOXIDANT ACTIVITY

HOU Fanyi，LIU Wei，WANG Fang
（School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

To improve the solubility of phenolic acids in the bulk oil，esterification is often used to improve their hydrophobicity.Coffeic acid is a kind of natural phenolic antioxidant，which has antibacterial，anti-tumor and antioxidant activities.In this study，octyl caffeate was synthesized using caffeic acid and octyl alcohol as raw materials，while acidic ion resin as catalyst without adding any other solvents.The highest conversion（98.84± 0.02）%of caffeic acid and the highest yield（98.18±0.83）%of octyl caffeate were achieved under the optimum conditions，which was showed as follows:0.25mmol of caffeic acid，2 ml of octyl alcohol，5%of Amberlyst 35（calculated by the total mass of the substrate），reaction temperature of 100℃ and reaction time of 6 h.The results of [DPPH·]scavenging activity and β-carotene protection experiments showed that hydrophobic modification could effectively improve the antioxidant activity of caffeic acid.

octyl caffeate；hydrophobic modification；antioxidant activity

TS201.2

B

1673-2383(2017)01-0021-06

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170222.1116.010.html

网络出版时间：2017-2-22 11:16:25

2016-07-17

河南省高等学校青年骨干教师资助计划（2014GGJS-058）；河南工业大学青年骨干教师培育计划（2014003）；河南工业大学2015年“优秀硕士学位论文培育”项目（PY_M2015001）

侯凡一（1990—），女，河南郑州人，硕士研究生，研究方向为油脂化学。

*通信作者