分光光度法测定水产品中的二甲胺

戚勃，杨少玲，杨贤庆，邓建朝，吴燕燕，陈胜军，黄卉，胡晓

(中国水产科学研究院 南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东 广州，510300)

分光光度法测定水产品中的二甲胺

戚勃，杨少玲，杨贤庆*，邓建朝，吴燕燕，陈胜军，黄卉，胡晓

(中国水产科学研究院 南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东 广州，510300)

建立了分光光度法测定水产品中二甲胺(dimethylamine，DMA)含量的方法。水产样品中的DMA用三氯乙酸提取、与铜铵试剂反应显色后用苯萃取，用分光光度计在波长434 nm测定吸光度值，根据标准曲线计算样品中二甲胺的含量。结果表明：反应体系在pH 12.0、50℃水浴时间3 min下显色良好，DMA浓度在0～10 mg/L内具有良好的线性关系，回归方程为y=0.057 4x-0.005 7(R2=0.999 7)，检出限为6 mg/kg。选用6种不同品种的水产品作加标回收率试验，其加标回收率为86.7%～99.2%，相对标准偏差为1.36%～4.78%。

二甲胺；水产品；分光光度法

二甲胺是一种常见低分子有机胺，通常存在于自然环境和水产品中，尤其是海产品中含量较高[1-2]。水产品中的DMA是由氧化三甲胺TMAO经酶或微生物分解作用生成，同时还生成等比例的甲醛。LIN[3]对17种海产鲜品中DMA含量进行调查，发现鲨鱼翅中DMA的含量高达895 mg/kg。BATTITT[4]和SPINELLI[5]在水产干制品中也检测到大量的DMA，并证明热处理和一些化合物都能够促进DMA的形成。研究证明，食品中的二甲胺能与亚硝酸盐形成致癌性很强的二甲基亚硝胺[6-7]。因此，二甲胺在水产品中的含量受到广泛关注，日本、中国台湾还将DMA作为水产品鲜度指标。

目前，对DMA测定方法较多，主要有分光光度法、液相色谱法、气相色谱法、离子色谱法、气相色谱-质谱联用和毛细管电泳等方法[8-11]。但是，这些方法主要用于肉制品和环境中二甲胺的检测。色谱类检测方法具有分离效率高、选择性高、灵敏度高、分析速度快、重现性好等优点，但是用色谱测定时，一般需要进行化学衍生处理，操作繁琐，耗时长，且衍生过程需加热会使样品中氧化三甲胺发生降解产生DMA，使得测定结果含量偏高，产生误差[12]，而且色谱类检测仪器昂贵，不利于在中小企业或普通实验室应用。我国还未有DMA在食品中的限量标准，也没有针对水产品中DMA测定的标准方法。因此，针对水产品建立简单、快捷、准确又能被广泛应用的DMA检测方法，具有重要的现实应用价值。

本文在参考文献[13]的基础上，通过三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)提取、铜胺试剂显色、分光光度计比色、优化测定条件，建立了水产品DMA的测定方法。分光光度法操作简单，无需特殊仪器，重现性、灵敏度均能达到食品检测的要求，有利于本方法的推广应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原材料

鱿鱼、海虾、蟹、蛤蜊肉、墨鱼、海参、龙头鱼等冷冻水产品，购自广州华润万家超市。

1.1.2 试剂

无水NaSO4、NaOH、苯、CS2、CuSO4、乙酸铵、氨水、盐酸二甲胺，均为分析纯；试验用水符合GB/T 6682规定的二级水标准。

1.2 主要仪器

紫外-可见分光光度计UV3000，上海美谱达仪器有限公司；25 mL具塞比色管、1 cm气密式石英比色皿；分析天平，密多利斯科学仪器北京有限公司；均质机，IKA；Na2SO4玻璃砂芯层析柱(内径×长度=10 mm×100 mm，填充约5 g无水Na2SO4)

1.3 实验方法

1.3.1 实验原理[13]

水产品中含有的二甲胺经过三氯乙酸提取后，在氨水共存的碱性溶液中，经剧烈摇动与CS2缩合生成二甲基二硫代氨基甲酸铵，该缩合物又与醋酸二价Cu2+反应生成黄色的络合物，经苯萃取后，用分光光度计在波长434 nm处比色定量测定。

1.3.2 主要试剂配制

(1)120 g/L NaOH：称取12 g NaOH，用水溶解，冷却后定容至100 mL容量瓶。

(2)铜铵试剂：分别称取25 g乙酸铵、10 g NaOH、0.2 g CuSO4，分别用少量水溶解，转入100 mL容量瓶，再加入20 mL浓氨水，用水定容至刻度。

(3)5%CS2苯溶液：吸取50 mLCS2于1 000 mL容量瓶，用苯定容至刻度。

(4)50 g/L三氯乙酸溶液：称取50 g三氯乙酸，用水溶解并定容至1 000 mL容量瓶。

(5)35%酸溶液：量取35 mL冰醋酸于100 mL容量瓶，用水定容至刻度。

(6)二甲胺标准储备液：称取经硅胶干燥器干燥的盐酸二甲胺0.180 9 g，用50 g/L三氯乙酸溶液溶解并定容于100 mL容量瓶，作为储备液。该储备液相当于二甲胺浓度1 000 mg/L，置4℃冰箱冷藏。

(7)二甲胺标准使用液：临用时吸取2.50 mL二甲胺储备液，移入50 mL容量瓶，用50 g/L 三氯乙酸定容至刻度。该标准使用液浓度为50 mg/L。

1.3.3 标准曲线绘制

分别吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和1.5 mL二甲胺标准使用液于25 mL比色管，再分别加入50 g/L的三氯乙酸溶液使各管总体积为5 mL，即相当于二甲胺系列浓度为0、1、2、4、6、8、10、15 mg/L，再分别加入1 mL 120 g/L NaOH、1 mL铜铵试剂和10 mL CS2苯溶液，混匀。在50℃水浴3 min，立即剧烈振摇150次，再加入1 mL 35%的醋酸溶液，立即振摇120次，静置30 min；吸取上层显色液，经Na2SO4玻璃砂芯层析柱过滤至10 mL具塞试管，吸取显色液于1 cm比色皿，以0管为参比空白，在434 nm处测定各管的吸光度值，以吸光度值对标准液浓度绘制标准曲线。

1.3.4 样品测定

1.3.4.1 样品处理

鱼经清洗、去皮，取背部肌肉；海虾清洗后去头、去壳、去肠腺，取整条虾肉；鱿鱼、墨鱼清洗后去头、去鞘、去内脏，取胴体部分；蟹清洗后去壳、去腮后取可食用部分(肉及腺体)；将取得的样品用绞肉机绞碎、混匀，及时测定，不能及时测定的样品放-18 ℃冰箱冻藏。

1.3.4.2 样品液制备

称取搅碎的肉样5 g，置于100 mL离心管，加入50 g/L三氯乙酸溶液45 mL，用均质机在10 000 r/min下匀浆约20 s，5 000 r/min下离心10 min，上清液经中速滤纸滤入100 mL容量瓶；沉淀再重复处理1次，合并2次滤液，再用50 g/L三氯乙酸溶液定容至刻度。

1.3.4.3 样品液测定

吸取样品溶液5 mL于25 mL比色管，再分别加入1 mL 120 g/L NaOH、1 mL铜铵试剂和10 mL CS2苯溶液，混匀。以下操作同标准曲线绘制方法。同时用50 g/L三氯乙酸作试剂空白，在434 nm处测定各管的吸光度值，根据标准曲线回归方程计算二甲胺浓度。

1.3.4.4 样品中二甲胺含量计算

样品中二甲胺含量计算按式(1)计算：

(1)

式中：x，样品中二甲胺含量，mg/kg；C，样品溶液二甲胺浓度测定值，mg/L；V，样品溶液定容体积，mL，m，取样量，g。

2 结果与分析

2.1 二甲胺测定波长确定

吸取DMA标准使用液0.8 mL，以下按照1.3.3的操作方法使之显色。显色液移入1 cm比色皿，用分光光度计在500～400 nm范围内间隔1 nm进行波长扫描(图1)。由图1可见，最大吸收峰出现在434 nm处，由此确定本方法DMA检测波长为434 nm。

图1 二甲胺吸收光谱图Fig. 1 Absorbtion spectrum of DMA

2.2 最佳pH值

二甲胺需要在碱性条件下发生缩合反应而最终显色，由于样品提取液为50 g/L的三氯乙酸溶液，测定时仅加入铜铵试剂，发现反应体系的pH值较低(pH 9.6左右)，灵敏度不高。因此需要另外添加一定量的NaOH中和过多的三氯乙酸，以提高pH值。为了确定添加NaOH的量，作NaOH加入量与吸光度之间的关系试验。分别吸取1 mL二甲胺标准使用液于9支25 mL比色管中，分别添加50 g/L三氯乙酸至5 mL，分别加入不同体积120 g/L NaOH溶液，以下步骤同1.3.3。同时做试剂空白试验，重复作3个平行试验，结果取平均值。NaOH加入量与吸光度的关系如图2所示。

图2 NaOH添加量与吸光度的关系Fig. 2 Relation between absorbensy and addition of sodium hydroxide

由图2可见，随着NaOH加入量的增加DMA吸光度也随之升高，当NaOH加入到0.8 mL后，吸光度值趋于平缓，当加到1.0 mL左右时(pH 12.0左右)，吸光度值达到最大值0.570；当加入量超过1 mL后，吸光度值开始下降。因此，本方法NaOH加入量确定为1.0 mL。

2.3 水浴时间

DMA显色反应需要在40～50℃的条件下进行，为了确定最佳反应条件，作水浴时间与吸光度之间的关系试验(图3)。

图3 水浴时间与吸光度之间的关系Fig.3 Relation between water bath time absorbensy

分别吸取1 mL二甲胺标准工作液于5支25 mL比色管中，分别添加50 g/L三氯乙酸至5 mL，以下同1.3.3加入试剂。同时作空白试剂试验。加完试剂后摇匀，同时放入50℃水浴锅，每间隔1 min各抽取1支比色管(分别代表水浴时间1、2、3、4、5 min)，立即剧烈振摇150次，再加1 mL 35%醋酸溶液，振摇120次，以下同标准曲线操作、比色。重复作3个平行试验，取平均值。

由图3可见，在50 ℃下水浴5 min时间内，随着时间的延长，吸光度值先升高、再趋于平衡，在显色3 min时，吸光度达到最大值(0.576)，即表示已反应完全。因此，本方法确定水浴条件为50℃下水浴3 min。

2.4 静置时间

经水浴剧烈振摇后的DMA显色液含有大量气泡和水分，需要静置一定时间，充分分层才能达到澄清、透明状态，比色时吸光度值也才能达到稳定。为了确定静置时间，作静置时间与吸光度之间的关系试验。吸取1 mL二甲胺标准使用液于6支25 mL比色管中，以下操作同1.3.3标准曲线绘制方法。同时做空白试验。水浴振摇显色后，静置60 min，每间隔10 min(分别代表静置10、20、30、40、50、60 min)取1支比色管的显色液进行比色。重复作3个平行试验，取平均值。静置时间与吸光度之间的关系见图4。

图4 静置时间与吸光度之间的关系Fig.4 Relation between standing time and absorbensy

由图4可见，经水浴后的DMA显色液，在静置60 min内，吸光度值变化不大，在0.566～0.581内，静置30 min时吸光度为0.577，静置60 min时吸光度值为0.581，说明静置时间对吸光度值影响并不明显。但是试验过程中发现，在静置20 min内进行比色，吸光度值读数不稳定。这可能是由于在短时间内静置，DMA显色液还不能降低到室温，显色液中的苯挥发较快，造成显色液浓度升高，吸光度值变大。静置30 min时，比色时吸光度读数趋于稳定。因此，本方法确定显色后的DMA宜静置30 min后再进行比色测定。

2.5 显色稳定性

为了考查本方法显色液的稳定性，将1.3.3绘制标准曲线后剩余的显色液放置1 d后再比色，比较其吸光度值变化情况(表1)。由表1可见，DMA显色液放置1 d后，其吸光度值略微升高，这可能是由于在放置过程中，苯有微量挥发导致显色液浓度略微升高，因此吸光度值变大，但是吸光度值变化幅度在0.006内。因此本方法具有良好的稳定性。

表1 显色稳定性试验

注：*标准曲线测定数据。

2.6 标准曲线

对1.3.3显色液用分光光度计在波长434 nm处进行比色，以DMA浓度x为横坐标，吸光度y为纵坐标绘制DMA标准准曲线，如图5所示。

图5 二甲胺标准曲线Fig. 5 Standard curve of DMA

由图5可见，标准曲线在0～15 mg/L(相当于样品0～300 mg/kg)浓度范围内具有良好的线性关系，回归方程为y=0.057 4x-0.005 7，相关系数R2=0.999 7。

2.7 检出限

根据国际理论与应用化学联合会(IUPAC)的规定[14]，分光光度法检测样品，以扣除空白值后的吸光度为0.01相对应的浓度即为检出限。试验配制一系列低浓度的DMA标准溶液，按照1.3.3标准曲线操作方法测定其吸光度，根据相关数据的线性关系和吸光度值确定方法的检出限，试验结果如表 2 所示。

表2 检出限试验结果

由表2可见，DMA浓度为0.3 mg/L时，吸光度值为0.012，接近检出限吸光度值。因此，本方法测定DMA的方法检出限为0.3 mg/L，相当于样品的检出限为6 mg/kg。

2.8 精密度

精密度试验采用3个标准浓度(1、6、10 mg/L)进行试验，每个浓度测定6次，结果如表3所示。

表3 精密度试验结果

由表3可知，该方法测得3个不同浓度的标准溶液RSD值分别为6.42%、2.22%和1.41%，除低浓度(1 mg/L)RSD略高于5%，其他浓度的RSD均低于5%，说明本方法具有良好的重现性，准确度高，条件合理。

2.9 回收率

取6种不同的海产品，根据样品本底含量不同，向样品中分别添加不同量的DMA标准溶液，按照本试验方法进行样品测定，每个加标浓度作3个平行，结果如表4。

表4 样品回收率试验

由表4可见，6种海产品的加标平均回收率在86.7%～99.2%，且RSD在1.36%～4.78%，均<5%，说明本方法测定水产品中的DMA具有很好的准确度。

3 结论与讨论

本试验建立了水产品中DMA含量的分光光度法测定方法，优化了最佳测定条件：测定波长434 nm、显色pH 12.0、水浴时间为3 min(50 ℃)、显色后静置分层时间30 min，方法灵敏度b=0.057 4，样品检出限6 mg/kg；样品用50 g/L三氯乙酸提取2次、加标回收率均达85%以上，相对标准偏差RSD均<5%，该方法灵敏度高、重现性好，仪器要求不高，符合水产品中二甲胺的检测要求。

本检测方法对比色皿有较为严格的要求，宜采用气密式烧制成型的石英或玻璃比色皿。由于本方法显色液为CS2苯液，属于极易挥发性有机试剂，对有机材料或黏结剂具有较强的腐蚀和溶解作用。在试验过程中，未能充分考虑到这一特性，曾采用胶黏结成型的玻璃比色皿或一次性有机玻璃比色皿，显色液对这两种比色皿造成脱胶或溶解性损坏；使用不带盖或普通塑料盖片的比色皿，由于密封性不好，比色皿中的苯不断挥发造成显色浓度不断升高，比色过程中读数不断升高，无法稳定读数。本试验最后选用了气密式烧制成型的石英比色皿，显色液既不会损坏比色皿，比色时读数也很稳定。

实验表明，酸碱度对吸光度影响较大。参考文献[15]Dyer法pH 10左右，许龙福[13]采用4%高氯酸，用80 g/L NaOH调pH 11左右，吸光度均偏低。为提高灵敏度，本法根据文献[13]提示，改加1 mL 120 g/L NaOH提高pH 12左右，此时提高了测试灵敏度。

试验采用低浓度50 g/L TCA提取DMA，取得较好的准确度。在预实验中，参考许龙福[13]和李丰[12]的方法，分别采用不同浓度的高氯酸和三氯乙酸进行DMA提取，发现TCA更易使样品中的蛋白质沉淀，样品处理液变得澄清透明，因此选用TCA作为样品处理液。在样品处理时，预期通过提高TCA的浓度，以缩短样品处理时间和效果，但是提高了TCA的浓度，在测定时需要添加更多NaOH中和TCA，对测定结果产生明显的干扰。通过反复对比试验，采用50 g/L TCA提取DMA得到了良好的结果。据此，标准液配制以及样品处理液均采用50 g/L TCA，保证了标准液与样品待测液pH值一致，提高了测定准确度。

显色液比色前进行Na2SO4脱水为本方法的关键。标准液经剧烈振摇后的显色液中混有许多微小致密的水泡，样品待测液中或多或少还残留有微量蛋白质等有机物质，加入CS2苯液经剧烈振摇，显色液中会出现微量微小悬浮物，在静置分层的过程中很难完全沉降到水层，因此显色液变得略显浑浊，导致比色结果偏高。本试验改变直接往显色液中加入Na2SO4的脱水方法，采用Na2SO4层析柱过滤式脱水，使得脱水完全，同时也能够过滤掉显色液中的微小悬浮物，使显色液澄清、透明，消除了比色干扰。另外，试验中也尝试先采用0.45 μ的滤膜对样品待测液进行过滤后再测定，试验结果发现效果与直接用Na2SO4层析柱过滤结果一样，为节约成本和减少操作，试验采用Na2SO4层析柱过滤法脱水。

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Spectrophotometry detection of dimethylamine in aquatic products

QI Bo，YANG Shao-ling，YANG Xian-qing*，DENG Jian-chao，WU Yan-yan，CHEN Sheng-jun， HUANG Hui，HU Xiao

(South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture, National Research and Development Center for Aquatic Product Processing, Guangzhou 510300, China)

A method for determining dimethylamine (DMA) in aquatic products was established using spectrophotometry. The DMA in aquatic products was extracted by TCA, after color reaction with copper-amine, it was then extracted by benzene. The absorbance of DMA colorimetric solution at 434 nm; the content of DMA was calculated based on the DMA standard curve. The results shows that：the color was kept well under pH 12.0 and water bath at 50℃ for 3 min. Under the optimal conditions，the standard curve was linear in the range of 0-15 mg/L for DMA with a detection limit of 6 mg/kg，the regression equation of the concentration(x) and the absorbance(y) of DMA wasy=0.057 4x-0.005 7 and correlation coefficient wasR2=0.999 7. The average recoveries for DMA at three spike levels for six different kinds of aquatic products were in the ranges of 86.7%-99.2%，with relative standard deviations (RSD) of 1.36%-4.78%. Therefore，this method is simple，and the result is reproducible and sensitive. Therefore, it is suitable for common laboratory usage.

dimethylamine; aquatic products; spectrophotometry

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705034

硕士,副研究员(杨贤庆研究员为通讯作者，E-mail：yxqgd@163.com)。

广东省科技计划项目(2013B021100013)；国家“十二五”科技支撑计划项目(2015BAK36B06，2015BAD17B03-1)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2016TS05，2016TS11)

2016-07-22，改回日期：2016-10-07