QuEChERS前处理高效液相色谱法同时测定酵母产品中7种合成酚类抗氧化剂

李艳美，粟有志，李芳，雷红琴，袁小雯，张凯丽，杨洁

1(新疆大学 生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐，830046)2(伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心，新疆 伊宁，835000)

QuEChERS前处理高效液相色谱法同时测定酵母产品中7种合成酚类抗氧化剂

李艳美1,2，粟有志2，李芳2，雷红琴2，袁小雯2，张凯丽2，杨洁1*

1(新疆大学 生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐，830046)2(伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心，新疆 伊宁，835000)

建立了QuEChERS-HPLC同时定量测定酵母中的没食子酸(GA)、没食子酸丙酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、没食子酸异戊酯(IAG)、没食子酸辛酯(OG)、没食子酸十二酯(DG)和二丁基羟基甲苯(BHT)7种合成酚类抗氧化剂(SPAs)的分析方法。样品用乙腈提取，经PCX粉净化，以JADE-PAK C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)分离，采用1%乙酸水溶液和甲醇为流动相梯度洗脱，二极管阵列检测器(DAD)检测，结合保留时间和紫外光谱进行定性分析，定量波长280 nm。7种合成酚类抗氧化剂(SPAs)在各自的范围内相关系数(r2)均大于0.994，定量限(LOD，S/N=10)为1～10 mg/kg；3个加标水平(1、2、10倍定量限)下，活性干酵母和酵母抽提物中回收率分别在79.7 %～102.4 %和79.3 %～107.4 %，相对标准偏差(RSD)分别在2.5 %～8.7 %和2.7 %～9.6 %。该方法准确快速、灵敏度高，适用于酵母产品中7种合成酚类抗氧化剂(SPAs)的同时测定。

合成酚类抗氧化剂；酵母产品；高效液相色谱法；QuEChERS

酵母产品是以糖蜜、淀粉类为碳源，添加氮源、磷源等酵母细胞生长繁殖所需要的营养素，经培养、分离、过滤、干燥等工序制成[1]。具有发酵、改善风味、增加营养价值等作用，广泛用于酿造啤酒、制药、制茶、饲料加工等行业。在酵母生产中应用合成酚类抗氧化剂(synthetic phenolic antioxidants,SPAs)，以减少储存过程中因细胞成分被氧化而造成的活性损失[2]。化学合成抗氧化剂会对人体造成不同程度的潜在危害[3-5]，许多国家对其添加量加以限制或明确规定其添加量[6-7]。目前，抗氧化剂的检测样品主要集中在食用油脂、含油脂食品及动物饲料中[8-11]，未见检测酵母产品的报道。为防止不法厂家超范围、超限量使用合成酚类抗氧化剂，建立一种快速、灵敏的分析酵母产品中合成酚类抗氧化剂的方法是十分必要的。

合成酚类抗氧化剂检测标准[12-15]和方法很多，薄层色谱法[16]和比色法[12]检验步骤复杂，检出限高；较准确分析抗氧化剂含量的方法主要是气相色谱法[11-12,14,19]、液相色谱法[13,15,20]、气相质谱法[9,18]、液相质谱法[10,15,17]等，而气相色谱法和气相质谱法需要大量的有机溶剂；液相质谱法检测成本高，仪器价格昂贵。这些检测方法的前处理既耗时又费力，本研究采用以快速、简单、廉价、高效、耐用、安全著称的QuEChERS 样品前处理技术[21-23]， 结合液相色谱，用二极管阵列检测器检测酵母产品中7种合成酚类抗氧化剂(SPAs)，该方法准确快速、灵敏度高，检测效率高，为酵母产品中合成酚类抗氧化剂的检测提供了实用的技术手段。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪(配有二极管阵列检测器、自动进样器、色谱工作站)，美国Agilent公司；Sigma3-18K台式冷冻离心机，Sigma公司；EYELA MMV-1000W振荡器，东京理化公司；SK8210LHC超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；N-EVAP-112水浴氮吹仪，Organomation公司；MiIIi-Q Advangtage A10 超纯水系统，Millipore公司；MS3型涡旋振荡器，IKA公司。

没食子酸(gallic acid，GA，纯度97.8%)，没食子酸丙酯(propyl gallate，PG，纯度99.9%)，叔丁基对苯二酚(tertiary butylhydroquinone，TBHQ，纯度97.5%)，没食子酸异戊酯(isoamyl gallate，IAG，纯度98%)，没食子酸十二酯(dodecyl gallate，DG，纯度98%)，二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT，纯度99.0%)标准品(均为固体)，德国Dr.Ehrenstorfer公司；没食子酸辛酯(octyl gallate，OG，纯度99.52%)，上海安谱试验科技股份有限公司；乙睛、甲醇、丙酮、甲酸和正己烷均为色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司；冰乙酸(优级纯)试验用水为Milli-Q超纯水(符合GB/T 6682-2008一级水要求)；酸性氧化铝(ALA)，振翔公司；硫酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)、C18粉、N-丙基乙二胺(PSA)、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)、石墨化炭黑(GCB)、氨基(NH2)均购自Agela公司；分析样品为实验室送检和市售样品。

1.2 标准溶液的配制

1.2.1 标准储备液的制备

分别准确称取没食子酸(GA)、没食子酸丙酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、没食子酸异戊酯(IAG)、没食子酸辛酯(OG)、没食子酸十二酯(DG)和二丁基羟基甲苯(BHT)7种标准品各100 mg(精确到0.000 1 g)于10 mL容量瓶内，用甲醇定容至刻度线，配置成质量浓度为10 g/L的标准溶液，转移至12 mL棕色小瓶内，储存于4 ℃冰箱内备用。

1.2.2 混合标准液的制备

根据不同合成酚类抗氧化剂标准物质的响应灵敏度，确定其在混合标准溶液中质量浓度，用甲醇稀释标准储备溶液至中间混合标准溶液中各抗氧化剂的最终浓度如下：没食子酸辛酯(OG)、没食子酸丙酯(PG)、没食子酸(GA)为250 mg/L；没食子酸十二酯(DG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)为500 mg/L；没食子酸异戊酯(IAG)为100 mg/L；二丁基羟基甲苯(BHT)为1 000 mg/L。

1.3 样品前处理

称取1 g样品(精确到0.01 g)于具塞离心管，加入10 mL乙腈，2 500 r/min充分涡旋振荡3min，加入2 g NaCl，2 500 r/min涡旋振荡1 min，超声2 min。置于离心机8 000 r/min离心5 min，取2 mL乙腈层于具塞离心管中，加入吸附剂PCX 0.1 g，涡旋振荡1 min，置于离心机8 000 r/min离心5 min，取上清液至于玻璃试管中，常温水浴氮吹至干，用1 mL甲醇溶解残渣，过0.22 微孔滤膜过滤，滤液待测。

1.4 仪器条件

色谱柱：JADE-PAK C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；流动相：A相为1 %乙酸水溶液，B相为甲醇，梯度洗脱(见表1)；流速：0.800 mL/min；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：280 nm；进样量：2 μL；运行时间：15 min。

表1 梯度洗脱表

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

将本实验中检测的7种SPAs配制的单一标准溶液，采用二极管阵列检测器在190 nm～400 nm的波长范围内进行波长扫描。其中分子结构式相似的没食子酸型抗氧化剂(GA、PG、IAG、OG、DG)，均含有的3个羟基苯环提供了主要的紫外特征吸收，致使这5种没食子酸型抗氧化剂的波长扫描图相似，最大吸收波长接近，且均在272～274 nm，而另外2种抗氧化剂(TBHQ、BHT)最大吸收波长分别为290 nm、278 nm。综合考虑，选择波长为280 nm作为7种SPAs的最佳检测波长。图1为7种SPAs的混合标液在280 nm的波长下进行梯度洗脱后所得到的色谱图。

1-GA；2-PG；3-TBHQ；4-IAG；5-OG；6-DG；7-BHT图1 混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of the mixed standard solution

2.2 提取溶剂的选择

比较了极性试剂水、乙腈、甲醇、乙腈-甲醇(1∶1v/v)、水-甲醇(1∶1,v/v)、水-乙腈(1∶1,v/v)对7种SPAs的提取效果。图2为不同溶剂提取7种SPAs的回收率。结果发现水做提取剂时，对DG的提取效果不理想；甲醇和1∶1 乙腈水溶液做提取剂时，对GA的提取回收率也只有30%左右；虽然1∶1 甲醇水溶液做提取剂时回收率较集中在68%～88%；而乙腈做提取剂时，7种SPAs的回收率均>90%，满足检测要求。综合考虑，选取乙腈作为提取剂。

1-GA；2-PG；3-TBHQ；4-IAG；5-OG；6-DG；7-BHT图2 不同溶剂提取SPAs的回收率Fig.2 Recoveries of SPAs extracted by different solvents

2.3 净化条件的选择

QuEChERS前处理净化过程包括干扰目标分析物杂质的去除以及影响回收率酵母产品基质的去除，比较了酸性氧化铝(ALA)、硫酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)、C18粉、N-丙基乙二胺(PSA)、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)、石墨化炭黑(GCB)、氨基(NH2)7种吸附剂对样品的净化效果。图3为不同吸附剂对7种SPAs的净化回收率。实验结果表明：采用ALA净化时，对没食子酸型抗氧化剂(GA、PG、IAG、OG、DG)无回收；PEP和NH2为净化剂时，没食子酸回收率为零，有部分抗氧化剂的回收率达不到检测要求；而GCB为净化剂时，对长链没食子酸酯类(没食子酸辛酯和没食子酸月桂酯)吸附过强，回收率为零，且部分抗氧化剂的回收率较低；PSA和C18净化剂吸附样品基质同时也吸附酚类抗氧化剂，从而导致目标物回收率低，部分抗氧化剂的回收率只有40%～55%；PCX净化时7种目标物的影响最小，回收率较高。图4(A)中a为未加净化剂的活性干酵母样品图谱，c为加入C18净化剂的活性干酵母样品图谱，去除干扰目标峰的杂质不明显，b为加入PCX净化剂的活性干酵母样品图谱，使样品基线噪音明显降低，尤其是对影响GA、PG出峰的杂质净化较好，因PCX属于阳离子聚合物，具有离子交换与反相保留双重保留模式，有机提取溶液乙腈沉淀了样品中的蛋白，PCX又对样品中碱性基质化合物的吸附较强，从而使样品提取液较为清澈，降低样品基质干扰。实验还考察了PCX加入量50 、100、200、300 mg对净化效果的影响，发现PCX加入量100 mg时，去除酵母产品中的杂质峰较好，因此，选用0.1 g PCX作为样品前处理时的吸附剂。

1-GA；2-PG；3-TBHQ；4-IAG；5-OG；6-DG；7-BHT图3 不同吸附剂对7种SPAs的净化回收率Fig.3 Purification effect of 7 SPAs with different adsorbent

a-未加净化剂;b-加入PCX净化剂;c-加入C18净化剂；1-GA；2-PG；3-TBHQ；4-IAG；5-OG；6-DG；7-BHT图4 活性干酵母样品(A)及加标活性干酵母样品(B)的色谱图Fig.4 Chromatograms of active dry yeast(A)and spiked active dry yeast sample(B)

2.4 线性参数、检出限和定量限

按照表2的线性范围浓度配置混合标准曲线溶液。以峰面积(y)对合成酚类抗氧化剂的质量浓度(x)作线性回归，绘制标准曲线，7种SPAs各自的线性范围内的相关系数(r2)均大于0.994。方法的检出限(S/N>3)在0.3～3 mg/kg，定量限(S/N>10)在1～10 mg/kg。7种SPAs的线性参数、检出限和定量限详见表2。

2.5 方法准确度与精密度

选取活性干酵母、酵母抽提物为空白样品，以1、2、10倍LOQ为加标水平进行回收率实验。按照本文进行样品前处理和仪器条件测定，每一样品重复测定6次，其回收率详见表3。结果表明，活性干酵母中7种SPAs的回收率为79.7 %～102.4 %，相对标准偏差(RSD)在2.5 %～8.7 %；酵母抽提物中7种SPAs的回收率为79.3 %～107.4 %，相对标准偏差(RSD)在2.7 %～9.6 %。表明该方法的准确度高，通用性好。图4为活性干酵母样品及加标活性干酵母样品的色谱图。

表2 7种SPAs的线性参数、检出限和定量限

表3 不同基质中7种SPAs的回收率和相对标准偏差(n=6)

2.6 样品测量

利用本方法对样品(活性干酵母、酵母抽提物)进行7种酚类抗氧化剂含量的检测。实验结果表明，样品中均未检测出目标分析物。

3 结论

建立了以乙腈为提取剂，经PCX粉净化，高效液相色谱二极管阵列检测器测定酵母产品中7种SPAs的检测方法。对酵母抽提物和活性干酵母粉进行加标回收实验，结果表明，该方法操作简便、快速、节省溶剂、加标回收率良好、方法稳定，回收率高，能有效降低基质干扰，可为酵母产品中此类物质的风险监控提供可靠的技术支持。

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Simultaneous determination of 7 synthetic phenolic antioxidants in yeast products using QuEChERS sample preparation and high performance liquid chromatography

LI Yan-mei1, 2, SU You-zhi2, LI Fang2, LEI Hong-qin2, YUAN Xiao-wen2,ZHANG Kai-li2, YANG Jie1*

1(College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046,China)2(Comprehensive Technical Service Centre of Yili Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Yining 835000，China)

A method was developed for the simultaneous determination of 7 synthetic phenolic antioxidants(SPAs), including gallic acid(GA),propyl gallate(PG),tertiary butylhydroquinone(TBHQ),isoamyl gallate(IAG),octyl gallate(OG),dodecyl gallate(DG) and butylated hydroxytoluene(BHT), in yeast products by using high performance liquid chromatographic (HPLC) method. The yeast products was extracted with acetonitrile and then cleaned up by PCX. The separation of analytes was performed on a JADE-PAK C18column (4.6 mm×150 mm, 5 μm) by gradient elution using 1% aqueous acetic acid solution and methanol as mobile phase. The sample was separated and detected with photodiode array detector (DAD). The qualification analysis was performed by using retention time and UV spectrum, and the quantification analysis was based on the detection wavelength of 280 nm. The calibration curves showed good linearity for seven synthetic phenolic antioxidants (SPAs), and the correlation coefficients (r2) were higher than 0.994. The limits of quantification (LOQs, S/N>10) were in the range of 1-10 mg/kg. The average recoveries were in the range of 79.7 %-102.4 % and 79.3 %-107.4 % for seven antioxidants respectively in active dry yeast and yeast extract, with the relative standard deviations (RSDs) of 2.5 %-8.7 % and 2.7 %-9.6 % at the spiked levels of 1,2,10 LOQ. The method is accurate, rapid and sensitive, and suitable for monitoring of seven synthetic phenolic antioxidants (SPAs) in yeast products.

synthetic phenolic antioxidants(SPAs);yeast products; high performance liquid chromatography(HPLC);QuEChERS

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705032

硕士，工程师(杨洁教授为通讯作者,E-mail：1670330098@qq.com)。

国家质检总局科技计划项目(2016IK266)

2016-10-26，改回日期：2017-01-26