基于BSTFA衍生化法白酒不挥发有机酸研究

杨会，范文来，徐岩

(江南大学 生物工程学院，酿造微生物与应用酶学研究室，教育部工业生物技术重点实验室，江苏 无锡，214122)

基于BSTFA衍生化法白酒不挥发有机酸研究

杨会，范文来*，徐岩

(江南大学 生物工程学院，酿造微生物与应用酶学研究室，教育部工业生物技术重点实验室，江苏 无锡，214122)

白酒中不挥发性有机酸可能是白酒呈酸味的重要化合物，为明晰白酒原酒中不挥发性有机酸的组成与含量，采用N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA)衍生化结合气相色谱-质谱(GC-MS)研究白酒中不挥发有机酸，共检测到27种有机酸。通过定量这些有机酸在7种香型白酒原酒中的分布，发现羟基酸的种类最多，且总浓度最高。在检测的所有有机酸中乳酸含量最高，在几百mg/L至几个g/L之间，远远高于其他不挥发有机酸。大多数不挥发有机酸在酱香型、芝麻香型白酒中的含量较高，在清香和凤香白酒中的含量较低。

白酒；不挥发有机酸；衍生化；N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA)；气相色谱-质谱(GC-MS)

白酒有机酸对白酒的香气、味觉和口感有重要影响。有机酸不仅呈酸的气味，同时呈现酸味，是白酒中重要香气成分酯类的前体物质。白酒中有机酸通常分为挥发性有机酸和不挥发性有机酸。更多的研究关注白酒挥发性有机酸[1]以及对白酒香气的影响，而不挥发性有机酸研究较少，且主要集中在乳酸[2]、长链脂肪酸(如棕榈酸、油酸和亚油酸等)[2]的研究，以及芳香族有机酸(如苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸等)[3]香气的研究上，对不挥发性有机酸对口味和味觉的影响更鲜有报道。

不挥发性有机酸的检测方法主要有离子色谱法[4-5]、高效液相色谱法[6-7]、衍生化-气相色谱法[8-10]等。唐坤甜等[11]使用离子色谱法在白酒中检测到16种有机酸，包括6种不挥发有机酸即乳酸、山梨酸、柠檬酸、庚二酸、辛二酸和壬二酸。胡国栋等[12]将酒样旋转蒸发后直接用于气相色谱-质谱(GC-MS)分析，共检测到23种游离有机酸，但只有十二、十三酸、十四酸、十五酸、十六酸、十八酸、油酸、亚油酸、棕榈油酸、苯甲酸、2-苯乙酸和3-苯丙酸12种不挥发性有机酸；而使用N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA))衍生化结合GC-MS能检测到白酒中23种有机酸[13]。但遗憾的是该研究只定性定量了乳酸、琥珀酸、酒石酸、十二酸、十四酸、十八酸和油酸7种有机酸。石亚林等[14]使用衍生化结合GC-MS研究了白酒大曲及其原料中的游离有机酸，共检测到21种氨基酸和9种不挥发有机酸。衍生化方法可以提高有机酸的挥发特性，使其具有更好的色谱特性[8]，利于检测到更多微量的有机酸。

目前国内对白酒味觉与口感物质包括有机酸的研究较少，已经鉴定出的有机酸并不能重组出白酒的酸味与酸感。鉴于此，本研究使用BSTFA作为衍生化试剂衍生化白酒中的有机酸，结合GC-MS检测分析7种香型白酒中的不挥发有机酸，更全面地了解白酒中的有机酸构成与量比，为进一步改善和提高白酒的味觉与口感奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品：所有试验的样品皆为原酒，四川某著名浓香型原酒(70%vol)，北京某著名清香型原酒(63.6%vol)，贵州某著名酱香型原酒(54%vol)，江西某企业特香型原酒(59%vol)，陕西某著名风香型原酒(66%vol)，山东某著名芝麻香型原酒(62%vol)，河北某著名老白干香型原酒(66%vol)。

标准品与试剂：乳酸(lactic acid)、羟基乙酸(glycolic acid)、2-糠酸(2-furoic acid)、3-羟基丙酸(3-hydroxypropinic acid)、3-羟基丁酸(3-hydroxybutyric acid)、2-羟基-3-甲基丁酸(2-hydroxy-3-methylbutyric acid)、2-羟基-4-甲基戊酸(2-hydroxy-4-methylpentanoic acid)、2-羟基丁酸(2-hydroxybutyricacid)、苯甲酸(benzoic acid)、马来酸(maleic acid)、丁二酸(succinic acid)、2,3-二羟基丙酸(2,3-dihydroxypropanoic acid)、富马酸(fumaric acid)、3-苯丙酸(3-phenylpropionic acid)、苹果酸(malic acid)、DL-3-苯基乳酸(DL-3-phenyllactic acid)、十二酸(dodecanoic acid)、L-(+)-酒石酸(L-(+)-tartaric acid)、壬二酸(azelaic acid)、柠檬酸(citric acid)、十四酸(myristic acid)、棕榈油酸(palmitoleic acid)、棕榈酸(palmitic acid)、亚油酸(linoleic acid)、油酸(oleic acid)、吡啶(pyridine)、水杨苷(D-(-)-salicin)、磷酸二氢钠均为色谱级，购自Sigma公司；BSTFA(含0.1%TMCS)，购自Sigma公司；2-苯乙酸(2-phenylacetic acid)、磷酸为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、甲醇，色谱级，购自北京百灵威科技有限公司；超纯水(Milli-Q，实验用水均为煮沸并冷却至室温的超纯水)。

1.2 仪器与设备

仪器：GC Trace1310-MS TSQ8000三重四级杆气质联用仪(Thermo Scientific)；氮吹仪(Organomation公司)；旋转蒸发仪(Buchi公司)；超高效液相色谱仪(Waters UPLC H-Class)。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

按照文献[9]改进后预处理方法，取20 mL酒样，40 ℃真空旋转蒸发至1 mL，取浓缩20倍的样品100 μL于2 mL小瓶中，加入100 μL内标水杨苷(10 mg/L，溶于甲醇中)，室温下温和氮气吹干，待衍生化。

2-羟基-4-甲基戊酸、羟基乙酸、苯甲酸因其浓度较高，不需要真空旋转蒸发，直接取100 μL酒样于2 mL小瓶中，加100 μL内标水杨苷(5 mg/L，溶于甲醇中)，室温下温和的氮气吹干，待衍生化。

1.3.2 BSTFA衍生化

参照文献[9]改进后方法，氮气吹干后的样品，依次加入50 μL吡啶和100 μL BSTFA(含0.1% TMCS)，摇匀，70 ℃反应3 h，24 h之内完成检测。

1.3.3 GC-MS色谱条件

TG-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱(Thermo Scientific)；电子电离源；离子源温度：300 ℃；传输线温度280 ℃；电子能量：70 eV；发射电流：25 μA；扫描范围：50～750 amu；进样口温度280 ℃；载气：氦气(1 mL/min)；进样量：1 μL；升温程序：65 ℃维持2 min，6 ℃/min上升至280 ℃，维持5 min；分流比5∶1。

未知化合物的质谱与NIST08.L进行比对，已有标准品的成分通过与标准品的质谱和保留指数比对来定性。无标准品的物质，通过质谱进行临时性鉴定。

1.3.4 GC-MS定量方法

用46%vol酒精水溶液配制成初始浓度200 mg/L的各种有机酸标准储备液，并根据白酒中各物质浓度配制成合适浓度的有机酸标准品混合溶液，梯度稀释，各梯度标准液前处理方法和衍生化方法与样品一致。以有机酸与内标物的峰面积比为横坐标，质量浓度为纵坐标，建立标准曲线。检测限(LOD)为3倍信噪比时物质的质量浓度；定量限(LOQ)为10倍信噪比时物质的质量浓度。

1.3.5 UPLC定量乳酸方法

使用超纯水将样品酒精度稀释至15%vol左右，取1 mL过0.22 μm滤膜，备用。

用15%vol酒精水溶液配制成初始浓度10 g/L乳酸标准储备液，并进行梯度稀释(5 000，2 500，1 250，625.0，312.5，156.3，78.12，36.06 mg/L)，各梯度标准溶液前处理方法与样品一致。以乳酸峰面积为横坐标，质量浓度为纵坐标建立标准曲线。

UPLC色谱条件：T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters)；流动相：NaH2PO4水溶液(用磷酸调节pH至2.7)；流速：0.25 mL/min；波长：210 nm；进样量1 μL；柱温：40 ℃。

2 结果与讨论

本研究共检测到27种有机酸，其中2-羟基-4-甲基戊酸、苯甲酸和羟基乙酸由于色谱峰过载或相邻高浓度物质峰的影响，采用样品直接衍生化定量；乳酸因浓度过高使用UPLC直接定量；4-羟基丁酸为临时性鉴定和半定量。

2.1 标准曲线与回收率

有机酸的标准曲线相关参数如表1所示。所有物质的线性相关系数在0.981 8～0.999 9之间，检测限在5.038～1 904 ng/L，相对标准偏差在1.3%～12%，回收率在80%～112%，线性关系良好，具有良好的准确度和精密度。

2.2 白酒中不挥发有机酸

乳酸在检测到的7种香型原酒中含量均是最高的(366～1 581 mg/L)，远远高于其他有机酸。从含量上讲，它是白酒中最重要的有机酸。从香型区分上讲，酱香型、芝麻香型、老白干香型和特香型原酒含有最高的乳酸，其含量均超过1 000 mg/L(见表2)，而含量最低的是清香型和凤香型原酒。

表1 不挥发有机酸的标准曲线、定量离子、回收率、检测限和精密度

注：a：非衍生化测定，UPLC直接测定，单位mg/L。

含量在1～30 mg/L之间(没有检测到30～366 mg/L之间的有机酸)的不挥发性有机酸主要有2-糠酸、2-羟基-4-甲基戊酸、2-苯乙酸、3-苯丙酸、十二酸、十四酸、十六酸、亚油酸和油酸。这些酸中，含量最高的是十六酸(29.4 mg/L)，其次是2-羟基-4-甲基戊酸(9.16 mg/L)和亚油酸(8.53 mg/L)。十六酸主要存在于酱香型、老白干香型和浓香型白酒中，与以前检测结果3.10～23.5 mg/L类似[12]。2-羟基-4-甲基戊酸是早先关注较少的一个酸，呈酸味，在芝麻香型原酒中含量最高，达10 mg/L左右，在其他香型白酒中含量1.28～2.82 mg/L。该化合物已经在葡萄酒中检测到(约几百个μg/L级)，但在白兰地和威士忌酒中未检测到[17]。亚油酸主要存在于芝麻香型白酒中，再次是老白干香型、浓香型和酱香型白酒中，而在特香型、清香型和凤香型原酒中含量较低，仅几十个μg/L。2-糠酸也是早先关注较少的一种酸，没有香气，但呈皱褶涩味[15-16]，水溶液中的涩味阈值是160 μmol/L[15]。2-糠酸主要存在于浓香型和芝麻香型原酒中，其含量大于1 mg/L(表2)，而在清香型、凤香型原酒中未检测到(小于检测限)，在酱香型、老白干香型和特香型原酒中含量为μg/L级。芳香族的2-苯乙酸和3-苯丙酸曾经在香气研究[18]中检测到。2-苯乙酸在浓香型和酱香型原酒中含量最高(超过1 mg/L)，3-苯丙酸在特香型原酒中含量最高，在清香型、老白干香型白酒中未检测到。直链脂肪酸十二酸、十四酸和十六酸是常见的可检测的不挥发有机酸[12, 19]，油酸和亚油酸则是引起白酒降度混浊的重要化合物[20]。

除以上的有机酸以及含量最低的柠檬酸(羟基三羧酸，仅特香型原酒中含有2.66 μg/L)外，其余有机酸的含量均在0.1～1 mg/L(表2)，这些酸主要是羟基羧酸和二羧酸。羟基单羧酸主要包括羟基乙酸、3-羟基丙酸、2-羟基丁酸、3-羟基丁酸、4-羟基丁酸(临时鉴定的)、2-羟基-3-甲基丁酸、2,3-二羟基丙酸、DL-3-苯基乳酸；羟基二羧酸有苹果酸和酒石酸。与威士忌和白兰地等蒸馏酒相比，白酒中含有更多种类的羟基酸[17]。二羧酸包括马来酸、富马酸、琥珀酸和壬二酸。这些化合物中除了琥珀酸、壬二酸之外，其余的化合物均是首次确认其存在。

表2 不同白酒样品中不挥发有机酸的含量a

注：a：单位：μg/L，3次测定平均值；b：单位：mg/L，乳酸用UPLC定量，其余有机酸用GC-MS定量；c：低于检测限；d：半定量。

在检测到的羟基酸中，苹果酸(1.05 mg/L)和3-苯基乳酸(1.03 mg/L)含量最高(4-羟基丁酸是半定量的)。2,3-二羟基丙酸、2-羟基丁酸和酒石酸在白酒中的含量较低，均低于150 μg/L。研究发现某些细菌可将亮氨酸转化为2-羟基-4-甲基戊酸，将缬氨酸转化为2-羟基-3-甲基丁酸[17]。

二羧酸中马来酸在原酒中含量最高(1.37 mg/L)，其次是琥珀酸(659 μg/L)，再次是富马酸(302 μg/L)。马来酸又称顺-丁烯二酸，而富马酸是反-丁烯二酸，在原酒中顺式含量是反式含量的2.31～21.7倍。琥珀酸呈酸味，在水中的酸味阈值900 μmol/L[15]，该化合物在芝麻香原酒中的含量最高。原先认为只有豉香型白酒中才含有庚二酸、辛二酸和壬二酸[11]，但本研究在浓香型、老白干香型、酱香型和芝麻香型原酒中均检测到壬二酸，未检测到庚二酸和辛二酸。

从不挥发有机酸总量看，如果不考虑乳酸的含量，则芝麻香型原酒含量最高，高达61.7 mg/L，其次依次为老白干香型、浓香型和酱香型；特香型、凤香型和清香型原酒不挥发有机酸总量低于10 mg/L。如果将乳酸含量计算在内，则芝麻香型原酒含量最高，其次是老白干香型原酒，再次是酱香型和特香型原酒。

3 结论

采用BSTFA衍生化技术能够一次性地检测白酒中27种不挥发有机酸。在这些有机酸中羟基酸的种类最多，浓度最高。乳酸是所有不挥发性有机酸中含量最高的(几百到近千mg/L)，浓度远远高于其他酸；居第二位的是十六酸(几十mg/L级)，其次是2-羟基-4-甲基戊酸(仅十几个mg/L级)，其他的酸浓度均在μg/L至几个mg/L级。大多有机酸在酱香型、芝麻香型原酒中的含量相对较高，在清香型和凤香型原酒中含量较低。

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Characterization of non-volatile organic acids in Baijius (Chinese liquors) based on BSTFA derivatization coupled with GC-MS

YANG Hui，FAN Wen-lai*，XU Yan

(Lab of Brewing Microbiology and Applied Enzymology, Key Lab of Industrial Biotechnology, Ministry of Education,School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Non-volatile organic acids were important sour-tasting compounds in baijius (Chinese liquors). To get a better understanding for these compounds in raw liquors, an analytical method usingN,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) as derivatization regent coupled with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was applied. A total of 27 non-volatile organic acids were identified and quantitated in 7 different aroma types of Baijiu. The results showed that much more hydroxy acids were detected, and their total concentration was the highest among 27 non-volatile organic acids in all samples. The concentration of lactic acid was up to several hundreds even thousands of mg/L, which was much higher than those of other non-volatileorganic acids in all liquors. Overall, the contents of most of the non-volatile organic acids in Jiang-flavour (soy sauce aroma type) and Zhima-flavour (roasted-sesame-like aroma type) Chinese spirits were relatively high, while those in mild flavor (light aroma-type) and Feng-flavour (feng aroma-type) Chinese spirits were low.

Baijiu(Chinese liquor)；non-volatile organic acids, derivatization；N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide(BSTFA)；gas chromatography-mass spectrometer(GC-MS)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705031

硕士研究生(范文来研究员为通讯作者,E-mail: Wenlai.Fan@163.com)。

十三五国家重大专项(2016YFD0400500)

2016-10-29，改回日期：2016-12-22