橙皮苷对IgA肾病大鼠肾脏组织中PAI-1蛋白表达的影响

何 伟，陈明喆,2*

(1.鄂东集团黄石市中心医院，湖北 黄石 435000； 2. 湖北理工学院附属医院，湖北 黄石 435000）

橙皮苷对IgA肾病大鼠肾脏组织中PAI-1蛋白表达的影响

何 伟1，陈明喆1,2*

(1.鄂东集团黄石市中心医院，湖北 黄石 435000； 2. 湖北理工学院附属医院，湖北 黄石 435000）

目的 探讨橙皮苷对IgA肾病大鼠纤溶酶原激活物抑制物（PAI-1）表达的影响。方法 60只雄性SD大鼠，随机分为正常组，模型组和橙皮苷治疗组，每组20只，模型建立成功后给予相应药物治疗，于治疗4、8周后处死大鼠各半，检测血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN），肾脏病理学，同时半定量PCR和Western Blot测定PAI-1蛋白和mRNA表达水平。结果 造模期间模型组、治疗组与正常组相比，大鼠第6周末开始出现镜下血尿（P ＜0.05），橙皮苷治疗后，有一定下降（P ＜0.05）；与正常组相比，模型组血清24 h UP、Scr、BUN、IL-2和PAF明显升高（P ＜0.05），治疗组治疗4周后明显下降（P ＜0.05），治疗8周后进一步降低；PLT和PT在治疗前后没有明显变化；与正常组相比，模型组APTT明显降低（P ＜0.05），治疗4周后明显升高（P ＜0.05），治疗8周后进一步升高；光镜下正常组大鼠肾小球形态正常，模型组肾小球系膜细胞和系膜基质中重度增生，橙皮苷治疗后肾小球系膜细胞和系膜基质增生得到明显缓解；与正常组相比，模型组PAI-1蛋白和mRNA表达明显降低，橙皮苷治疗4周后明显升高（P ＜0.05），治疗8周后基本和治疗4周后一致。结论 橙皮苷可明显减少血尿、减轻病理改变，改善肾功能，其机制可能是橙皮苷通过增加PAI-1的产生而发挥作用的。

IgA 肾病； 橙皮苷； 纤溶酶原激活物抑制物

IgA肾病是原发性肾小球疾病中最为常见的一种，本病临床中主要特点为免疫复合物沉积于肝脏，导致不易排出有毒物质[1-2]。橙皮苷是从橙皮中提取的一类化合物，目前已有研究[3]用其治疗糖尿病肾病的报道，但将其用于IgA肾病的研究还没有文献报道。本次研究笔者采用口服牛血清白蛋白、尾静脉注射葡萄球菌肠毒素 B以及皮下注射四氯化碳的复合方法制造IgAN大鼠模型，观察橙皮苷对其是否有治疗作用，并分析其治疗的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 60只清洁级雄性SD大鼠，体质量180～200 g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供，大鼠在购买后饲养于标准饲养间，每日日照和光照时间共为12 h。

1.1.2 试剂 橙皮苷购于湖北天合化工有限公司；葡萄球菌肠毒素和牛血清白蛋白购于美国Sigma公司；蓖麻油购于湖南尔康制药公司；四氯化碳购于中国国药公司；大鼠IL-2和PAF Elisa试剂盒购于武汉biosweap公司；ECL发光试剂盒、PVDF膜、多克隆抗体PAI-1以及单克隆抗体b-actin购于美国Santa cruz公司；相应二抗购于北京中衫金桥公司。组织蛋白裂解液、组织蛋白提取试剂盒以及BCA蛋白定量试剂盒购于碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型制作 大鼠在适应性喂养2周后随机分为正常组、模型组以及橙皮苷治疗组，每组20只。造模方法参照文献[4]进行:1)采用隔日血清白蛋白给予大鼠灌胃6周，每周灌胃400 mg/持续6周；2)大鼠每周注射1次0.5 m L蓖麻油和0.1 mL四氯化碳，共9周，分别于第6、8周给予大鼠脂多糖0.05 mg尾静脉注射；10周后观察大鼠是否造模成功。造模成功后，橙皮苷治疗组给予橙皮苷灌胃，灌胃量10 mg/（kg.d），模型组和正常组给予生理盐水1 m L/（kg.d）灌胃参照，分别于4、8周后处死大鼠各半。

1.2.2 标本收集 1）尿液收集: 分别于造模6、10周，治疗4、8周后将大鼠置于鼠代谢笼中收集24 h尿液，在收集尿液过程中由其自由饮食。2）血液收集：分别于治疗4、8周后，用戊巴比妥麻醉大鼠，大鼠麻醉后固定于固定板上，沿其腹中线切开腹部皮肤，暴露腹腔，之后切开胸腔膜找到心脏后，用注射器沿大鼠心尖处抽取血液，血液收集后，4 000 r/min离心，后将血清置于- 80 ℃超低温冰箱保存。3）肾脏收集：血液收集后立即分离肾脏，将肾脏组织周围结缔组织剥离后，统一切左肾约1/4置于中性福尔马林溶液中保存用于检测肾脏病理学改变，肾脏其余组织置于- 80 ℃超低温冰箱保存。

1.2.3 肾组织病理学检查 将中性福尔马林溶液中的肾脏组织取出，取出后用梯度乙醇脱水、脱水后用二甲苯透明并浸蜡，之后包埋、切片，最后行HE染色完成。

1.2.4 指标学检查方法 1)尿液检测：大鼠24 h蛋白尿定量的测定采用磺柳酸一硫酸钠比浊法；尿中红细胞定量采用尿沉渣计数法检测法。2)血液肾功能和高凝状态指标检测：血清收集后交由黄石市中心医院检验科完成。3)血清中IL-2和PAF的测定严格按照试剂盒进行，测试方法为双抗体夹心法。

1.2.5 肾组织PAI-1 mRNA的检测 采用半定量RTPCR法进行，每组实验重复3次。

1.2.6 PAI-1蛋白表达的检测 采用Western Blot法进行，每组实验重复3次。

1.3 统计学方法 数据学统计采用SPSS 19.0统计软件进行，计量资料以均值±标准差）表示，组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用LSD检验，P ＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 正常组大鼠饮食和饮水均完全正常，同时精神良好，活泼好动，毛发有明显光泽，造模成功后，模型组和橙皮苷组均有不同程度的食欲降低，同时精神萎靡，毛发明显杂乱发黄，橙皮苷治疗4周后，上述症状均有一定的好转，治疗8周后，进一步好转，但和正常组比较仍有一定的差异。

2.2 尿红细胞计数比较 见表1。

表1 治疗4、8周后大鼠肾功能基本指标评价尿红细胞计数(x±s，n=20）

2.3 肾功能相关指标比较 见表2。

2.4 大鼠高凝状态指标比较 见表3。

2.5 血清IL-2和PAF的测定比较 见表4。

表2 治疗4、8周后大鼠肾功能基本指标评价(x±s，n=20）

表3 治疗4、8周后各组大鼠高凝状态指标学统计(sx±，n=20）

表4 治疗4、8周后大鼠血清中IL-2以及PAF含量变化(sx±，n=20）

2.6 HE染色 HE染色可见，正常组大鼠细胞形态正常，同时细胞系膜没有增生，而模型组肾则有明显的肾小球系膜细胞和基质增生，同时细胞间有纤维化的存在，治疗组治疗后，其肾小球系膜增生反应有明显改善，但是较正常组仍然差异较大。

2.7 肾脏组织中PAI-1蛋白和mRNA表达 见表5。

表5 治疗4、8周后大鼠肾脏组织中PAI-1蛋白和mRNA相对表达量(sx±，n=20）

3 小结

研究[5-9]表明，肾组织纤溶酶原激活物（PA）和其抑制物（PAI-1）蛋白与凝血系统障碍密切相关，其可能在IgA肾病和其他相关肾小球疾病中发挥着重要的作用[10]。虽然PA在肾脏细胞中分泌较多，但体内有一种抑制物可与其结合，造成PA失活，在所有的抑制物中以PAI-1 的作用最为突出[11-12]。研究[13]显示，当IgA肾病发生后，肾小球中PAI-1的表达会明显降低，这种降低造成了PA活性的增加，最终造成了血尿的发生。

研究[14-15]显示，橙皮苷对维持患者的渗透压、增强毛细血管的韧性、降低胆固醇以及糖尿病和心脑血管的辅助治疗方面也具有很好的疗效。本次研究采用橙皮苷治疗IgA肾病大鼠，结果显示：橙皮苷可明显减少IgA肾病大鼠血尿、减轻肾脏病理改变，改善其肾功能，其机制可能与其可以增加PAI-1的分泌有关。

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Effect study of hesperidin to PAI-1 protein expression of IgA nephropathy rats

HE Wei1, CHEN M ingzhe1,2*
(1.The Geriatrics Department of Huangshi Central Hospital, Huangshi 435000, Hubei Province, China ; 2 . Hubei Polytechnic University Affi liated Hospital, Huangshi 435000, Hubei Province, China )

Objective To investigate the effects of hesperidin to fi brinolytic enzyme original activators inhibitor (PAI-1) protein expression in IgA nephropathy of rats.Methods 60 male SD rats were random ly divided into the normal group, model group and hesperidin treatment group, each group were 20. After successful establishment of the model, the corresponding drugs were given. Half of the rats were sacrifi ced at 4 and 8 weeks after treatment, and to detected the serum creatinine (Scr), urea nitrogen (BUN), kidney pathology exam ination, using RT-PCR and Western Blot to detected the PAI-1 protein and mRNA expression.Results During the period of building models, model group and hesperidin treatment group compared w ith normal group rats began to appear m icroscopic haematuria from 6 week (P<0.05), after hesperidin treatment, which have a certain degree decreased (P<0.05); Compared w ith normal group, 24 hUP, Scr, BUN, IL-2 and PAF levels were increased signifi cantly in model group (P<0.05), after 4 weeks treatment significantly decreased (P<0.05), after 8 weeks treatment further reduce; PLT and PT did notchange signifi cantly before and after the treatment; Compared w ith normal group, APTT was signifi cantly decrease in model group (P<0.05), after 4 weeks treatment it was signifi cantly increased (P<0.05), after 8 weeks treatment it was further increase; Under light m icroscope, glomerular morphology of normal rats was normal, and mesangial cells and mesangial matrix of the model group had moderate and severe hyperplasia, the proliferation of glomerular mesangial cells and mesangial matrix was relieved after treatment w ith hesperidin; Compared w ith the normal group, the expression of PAI-1 protein and mRNA in the model group was signifi cantly reduced, and the level was signifi cantly increased after 4 weeks of treatment (P<0.05), A fter 8 weeks of treatment, the effect was consistent w ith the effect after treatment for 4 weeks.Conclusion: Hesperidin can obviously reduce the hematuria and alleviate pathological changes, improve renal function, the mechanism may be related w ith increase production of PAI-1.

IgA nephropathy; hesperidin; Fibrinolytic enzyme original activators inhibitor

R285.5

A

2095-6258（2017）03-0355-03

2016-05-01）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.03.004

云南省卫生厅立项，黄石市中心医院自筹项目“橙皮苷对IgA肾病大鼠的作用研究”（2014HS023）。

何 伟（1981-），男，硕士研究生，主要从事中西医结合治疗肾病的研究。

*通信作者：陈明喆，女，硕士,电话 -13669046312，电子信箱- kunhua6631@126.com