布鲁氏菌病检测的精细化操作

文│李永志（山东省邹城市城郊畜牧兽医工作站）

布鲁氏菌病检测的精细化操作

文│李永志（山东省邹城市城郊畜牧兽医工作站）

布鲁氏菌病可以通过消化道、呼吸道、微伤皮肤或黏膜感染。生活中，养殖人员、屠宰人员、食用未熟透羊肉人员、畜牧兽医工作人员中有感染者，有到养羊场户串门而引起的感染者，有自家不喂羊邻居喂羊的感染者，有放羊户从院门前经常经过引起的感染者，布鲁氏菌病的传染显得十分诡异。因此在开展畜间布病检测工作时，操作必须精细。

一、采样人员精细分工

1.采血人。技术要点是一针见血。采血人应按照防护程序做好个人防护，随保定人员进入采血现场，找到一个人和动物都碰不到的地方，将垃圾袋挂好，垃圾袋用来盛放采血用完的针头护套、针头、废弃药棉等废弃物。

在养羊场尽可能选在羊舍外的走道采血，户主2人保定羊。牛在牛栏内用保定绳拴系或颈夹拴系，由饲养员完成，2～3人保定，也可在挤奶厅护栏内采血。

待保定好后，从接样人手中接过药棉，找到羊、牛的颈静脉沟，在颈部上1/3与颈部中1/3交界处作为采血点，并对该采血点用药棉擦拭2～3圈消毒。待采血点消毒完，棉球顺手转入右手拇指与食指之间，左手按住消毒点下端的回血端，待血管膨胀后，右手接过采血针头，针头平行于颈静脉向上刺入0.5～1.0厘米，血液即可流出，接血人接入采血管。待血取出3～5毫升时，右手拔出针头，交给接血人，左手持干棉球按住针眼2～3分钟后，待针眼不出血，再以5%碘酊进行局部消毒，完成一个个体的采样，离开，再采下一个。

2.接血人。要求是适机配合采血人员，安全足量接出原血。接血人按照防护程序做好个人防护，带着一枚接血管、一套静脉血样采集针，带着药棉缸（里面含有配好的酒精棉球、碘酊棉球、干棉球），跟随采血人。待采血人要棉球、采血针时递上，待血从针头溢出插入真空管中，真空管中血液达到3～5毫升时，采血人拔出针头后，将真空管递给血样保管人。

3.血样保管人。血样保管人接到接血人的真空管后，用记号笔在真空管侧壁醒目处填好血样编号，然后把采血管放入离心管架中。

4.佩戴耳标人。接血人离开采样动物后，及时佩戴防疫耳标，可用自喷漆在羊、牛身上喷序号，便于扑杀阳性动物时确认。

5.现场记录人。现场记录人在采样单中填好所采样的血样编号及与之对应的羊、牛的耳标号等相关信息。

6.现场取证人。现场取证人随时将采血全过程真实情况拍摄下来。必须拍摄羊、牛等戴耳标照片、采血管及被采动物的照片、户主和畜舍背景照片。

二、采样过程精细操作关键点

1.所有采样工作人员都严格按照防护程序做好个人防护，尽量做到不要有皮肤暴露在外。

2.保定人员必须牢固保定好采样动物，严防保定不牢固击伤采样人员，或者针头误伤采样人员，否则采样不能进行。

3.保定羊采用双人保定较牢固，一人一手抓住羊对侧的耳或角，另一手勒住羊的下颌部，用力靠在身上；另一人一手抓住与羊耳、角同侧的腹肋部膝前皱襞处，另一手抓住用乳胶管绕圈勒住颈部下端，使颈静脉暴露凸显出来。实践中，这种保定法较好，采血较快。

4.牛可采用尾静脉采血，接触牛尾部，牛不易惊，牛尾神经相对迟钝，疼痛轻，保定省力，只需一人将牛牵好即可，应激小。

5.取完血样，采血人先拔出输入血针交给接血人，接血人一手持接血管另一手拔出输出血针。不能先拔输出血针再拔输入血针，这样容易引起血液喷溅，造成污染。

6.贮存运输，样品放入冷藏箱（2～8℃）内，防止震荡，当天连同采样单送至化验室检测。

7.采样人员必须身体健康，全身无伤口、指甲剪短，年龄30～50岁，采样前后必须通过医院、疫控中心等有相关资质单位的检测，检测结果布病为阴性的人员。

三、实验室检测

用虎红平板凝集实验做筛选检测，用酶联免疫吸附试验（ELISA）做确诊检测。按常规方法分离制备血清，血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血，无腐败气味。

1.虎红平板凝集试验精细操作关键点。对温度要求严格，整个实验要求室温在（22±4）℃。抗原与血清在室温条件下放置30分钟。判定结果要在白色背景、自然光下观察，不要在灯光下观察判定结果。每次试验应设阴性、阳性血清对照。受检血清在4分钟内出现肉眼可见的凝集现象者判定为阳性，成均匀粉红色者为阴性。虎红平板凝集抗原使用前应充分摇匀，方可使用。抗原出现污染或摇不散的凝集块者不得使用。

2.酶联免疫吸附试验（ELISA）精细操作关键点。ELISA法敏感性高，特异性强，操作简便、安全。间接ELISA高度敏感，但不能鉴别牛种布氏杆菌19号疫苗接种所产生的抗体。竞争ELISA可以排除牛种布氏杆菌19号疫苗所产生抗体的影响。

ELISA的灵敏度在1纳克/毫升水平以上，要尽量避免标本间的污染。从冰箱取出试剂及冷藏的待检标本于室温（18～28℃）下平衡30分钟再进行测试，剩余试剂及时封存，放入冰箱备用。加样器要经常清洗，定期校准。加样吸嘴保持洁净，吸量准确。加酶液时要垂直滴加到反应孔的中央，不要把酶液溅到或滴到反应孔的上部，以免洗板时不能彻底把酶液洗净而出现假阳性。尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，水的高度以浸过小孔1/3处为宜，孵育温度为（37±1）℃为宜，时间以试剂说明书为准。为避免蒸发，板上应加盖。洗板时要不时地观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水或蒸馏水冲洗管道，避免堵孔。加样时保持显色剂不外流，A、B液应避免接触金属器械。酶标仪波长设置要正确。

从养殖场户采集了牛、羊全血后，畜牧兽医行政部门应尽快检测确诊，尽快把确诊结果告知养殖场户，根据《动物防疫法》《布鲁氏菌病防治技术规范》等相关法律法规规定，对患病动物及其流产胎儿、胎衣、排泄物、乳、乳制品等及时进行无害化处理。