紫茎泽兰野外微生物堆肥及毒性评价

杨红军，杜如万，吴叶宽，王剑，王勇，赵建，梁永江，张长华，袁玲*



紫茎泽兰野外微生物堆肥及毒性评价

杨红军1，杜如万2，吴叶宽2，王剑2，王勇2，赵建3，梁永江3，张长华3，袁玲1*

(1.西南大学资源环境学院，重庆400715；2.四川省凉山州烟草公司，四川 西昌615000；3.贵州省烟草公司遵义市公司，贵州 遵义563000)

紫茎泽兰是我国危害最严重的外侵植物，具有动物、植物和微生物毒性，研究紫茎泽兰野外就地堆肥技术，评估腐熟效果，可为有效防除与资源化利用提供科学依据。在野外自然条件下，通过接种恶臭假单胞菌(Pseudomonasputitasp.)和热解纤维梭菌(Clostridiumthermocellumsp.)，同时添加尿素和硫酸钙以及覆盖农用薄膜研究紫茎泽兰生物堆肥效果，并评价紫茎泽兰发酵产物生物毒性。接种菌剂后，堆肥高温期(50.0 ℃～64.5 ℃)持续时间达22 d，石油醚提取物从3.15 g/kg降低至0.37 g/kg，80 d可充分腐熟紫茎泽兰。腐熟物料的pH、有机质、养分和重金属含量符合NY/525-2011国家标准，腐殖酸含量为8.42%。动物毒性试验表明，浸提液对小鼠体重增长无显著影响，心、肝、肾、肺等组织器官未见病理变化。用生物堆肥浸提液浸种，促进小麦种子发芽率指数、活力指数和苗高，分别比无离子水浸种提高了8.65%、28.79%和23.69%；在添加紫茎泽兰生物堆肥的土壤中，微生物碳氮和脱氢酶活性比不施肥和单施化肥显著提高。生物堆肥可野外就地腐熟紫茎泽兰，降解有毒物质，提供有机肥源，实现紫茎泽兰的经济、有效防除与资源化利用。

紫茎泽兰；微生物堆肥；效果；毒性评价

紫茎泽兰(Ageratinaadenophora)属菊科多年生恶性毒草，原产于南美洲，是我国危害最严重的外侵植物[1]。在西南地区，紫茎泽兰大规模入侵农田、森林、草场，并迅速向我国东部和北方蔓延[2-4]，造成了巨大生态灾难和经济损失[5]。

紫茎泽兰造纸纤维不够长，做饲料有毒，做燃料热值低[5]。但是，紫茎泽兰分布广，生长快，生物量大，富含有机质、氮、磷、钾和微量元素，是良好的有机肥源[6]。在农业生产中，施用有机肥均衡供给植物营养，改良土壤，提高作物产量品质[7]。研究表明[8]，紫茎泽兰内含单萜类、倍半萜类、三萜类、甾体类、黄酮类、苯丙素类及其衍生物等100多种化学物质。其中，阿魏酸、鞣质、克拉维醇、紫茎泽兰内脂、乙酸龙脑酯、芳樟醇、香豆素、伞形花酯、香草醛和泽兰酮类含量较高，具有动物、植物和微生物毒性。草食家畜误食后轻者代谢异常，重者死亡[9]；施入土壤抑制作物生长，造成减产[10]；并降低土壤微生物活性和种群多样性[11]。此外，紫茎泽兰生命力强，根、茎和种子均可再生繁殖，故不能直接施入土壤[12-15]。野外就地堆肥既可经济、有效地防除紫茎泽兰，又能生产有机肥。但紫茎泽兰的毒物抑制微生物活动，妨碍堆肥生物化学反应，影响堆肥腐熟[16-17]。堆肥微生物活动与通气、温度、水分、pH和C/N等密切相关[18-21]。野外堆肥处于自然状态，不能人工控制上述影响因素[22-24]。因此，紫茎泽兰野外就地堆肥的难度较大，需要深入研究。

四川省凉山州属亚热带印度洋季风气候，土壤深度风化，土壤粘重，酸性强，通气差，缺乏养分及有机质，紫茎泽兰的危害面积占幅员面积的13.41%[25]，腐熟紫茎泽兰可丰富有机肥源，促进当地农业生产。为此，利用恶臭假单胞菌(Pseudomonasputitasp.)和热解纤维梭菌(Clostridiumthermocellumsp.)组成的混合菌剂，研究了野外就地堆制紫茎泽兰的技术，并评价了紫茎泽兰有机肥对动物、植物和土壤微生物的毒性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

紫茎泽兰：含水量81.45%，N、P2O5和K2O含量分别1.61%、0.45%和2.17%(干基)。

腐熟剂：由恶臭假单胞菌(Pseudomonasputitasp.，活菌数3.01×109cfu/g)和热解纤维梭菌(Clostridiumthermocellumsp.，活菌数1.50×109cfu/g)组成。腐熟剂中的微生物经专门筛选，恶臭假单胞菌能以苯、菲和芘为碳源和能源，最适生长温度29.0 ℃，51.0 ℃停止生长；热解纤维梭菌的最适生长温度32.5 ℃，63.5 ℃停止生长。取10.00 g 菌剂，用100 mL无菌水震荡提取(250 r/min)，4000 r/min离心15 min，取1.00 mL上清液于25 mL PDA液体培养基中，14 d对菲、芘的降解率分别为73.14%和66.32%(30 ℃、150 r/min摇瓶培养，菲、芘浓度均为100 mg/L)。另取部分上清液，经超声波破碎，其中的CMC-Na纤维酶活力为16.4 μg/(min·mL)。

堆肥辅助剂：尿素和硫酸钙按2∶1混合。

供试动物：清洁级昆明小鼠，饲养于重庆市中药研究院实验动物研究所。遵循毒理试验的标准程序饲养受试动物[19]。

供试小麦(Triticumaestivum)：渝麦7号，为重庆市的主栽品种，购于重庆市北碚区种子公司。

供试土壤：位于四川省西昌市西溪乡(东经102.25°，北纬27.72°)，红壤，成土母质为第四纪红色坡积物，质地中壤，肥力中等，采集0～20 cm耕作层，拣除杂物，风干后过1 mm筛备用。土壤pH 5.58、有机质22.75 g/kg、全氮1.13 g/kg、全磷0.56 g/kg、全钾10.83 g/kg，有效氮、磷、钾依次为116.91 mg/kg、12.95 mg/kg和129.7 mg/kg。

1.2 试验设计

1.2.1 堆肥试验 于2015年9月分别在四川省凉山州会理和会东县等地进行。堆肥处理包括：(1)生物堆肥(用BC表示)：在收割紫茎泽兰的附近选择一块平地，先将新鲜紫茎泽兰铡成5～10 cm的长条，再堆成长条状(长×宽×高≈3.5～4.0 m×1.5～2.0 m×1.5～1.8 m)，每堆高20～30 cm时，撒少许腐熟剂和辅助剂，踩踏紧实，堆至规定高度后，覆盖农用塑料薄膜。每1000 kg紫茎泽兰约需腐熟剂2.5 kg，堆肥辅助剂4 kg。(2)自然堆肥(对照，CK)：在堆制紫金泽兰时，不加腐熟剂和辅助剂，但覆盖农用塑料薄膜，余同BC。试验重复4次，堆置80 d。

在堆肥过程中,分别用ZDR-11J自动温度记录仪(杭州路格科技有限公司制造)监测堆肥温度。在堆制0，5，10，20，30，40，50，60 d分别取样，置于索氏脂肪提取器内，石油醚加热(60 ℃)回流12 h，用残余法计算石油醚提取物含量。在堆制第80天，用NY/525-2011方法测定物料水分、有机质、N、P2O5、K2O、铅、铬、镉、汞、砷含量，用GB/T 11957-2001方法测定腐殖酸含量。

1.2.2 生物毒性评价 (1)动物毒性：堆制80 d后，取BC处理的紫茎泽兰物料，送重庆市中药研究院按照毒理学鉴定的标准方法进行动物急性毒性试验[26]。试验动物雌雄各半，称体重后饲养于试验房间适应3 d。然后，根据体重随机将小鼠30只分为2组，试验组20只(堆肥浸提液灌胃，堆肥物料∶水=1∶1000)和对照组10只(蒸馏水灌胃)，给药前禁食2 h。受试物剂量60 mL/kg，给药容积30 mL/kg，每日2次，间隔6 h，连续14 d。

在试验期间，分别于1，2，3，7和14 d 对小鼠称重；在试验结束后，对全部小鼠进行大体解剖。

(2)植物毒性：分别取新鲜、CK和BC处理的紫茎泽兰，晾干，粉碎，无离子水浸提(紫茎泽兰∶水=1∶1000)。取健康、饱满、一致的小麦种子，用0.5% H2O2消毒1 min，无菌水洗净，均匀地置于垫有双层滤纸的培养皿中(Ø=15 cm，30粒/皿)。在25 ℃条件下，用紫茎泽兰浸提液发芽，并培养幼苗至12 d，[(25±1) ℃，12 h光暗交替]，以无离子水处理为对照，重复4次。

每隔24 h统计种子的发芽率，计算发芽指数和活力指数[27]。发芽至12 d，测定苗高和胚根长度。有关计算公式如下：

发芽率=(种子的发芽数/试验种子的总数)×100%

发芽指数=∑Gt/Dt(Dt-发芽天数；Gt-第t天的发芽数)

活力指数=Gi×S(S-苗高，Gi-发芽指数)

(3)土壤微生物毒性：取1 kg 土壤置于塑料钵中，设置：对照(不施肥)、施用化肥(0.15 g 尿素、0.16 g 过磷酸钙和0.19 g 氯化钾)、施用有机肥(3 g 紫茎泽兰有机肥，干基用量相当于7500 kg/hm2，施氮量等于施用化肥处理)。肥土拌匀，加水至最大田间持水量的65%，25 ℃ 暗培养30 d，在培养期间，用称重法保持土壤含水量为最大田间持水量的(65±2)%，每处理重复3次。培养结束后，用氯仿熏蒸，0.5 mol/L K2SO4提取土壤微生物碳氮，K2CrO7氧化法测碳和腚酚蓝比色法测氮；用TTC法测定土壤脱氢酶活性[28]。

1.3 数据处理

采用Excel和SPSS 18.0统计软件分析试验数据。其中，堆肥温度、石油醚提取物、水分、pH、有机质、养分、重金属等数据采用成组数据差异显著性检验；堆肥生物毒性评价的数据采用方差分析，LSD多重比较的显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 堆肥温度和石油醚提取物的变化

由图1可见,生物堆肥的温度表现出明显的升温期、高温期和降温期。其中，升温期共16 d；高温期(50.0～64.5 ℃)持续21 d；然后，堆肥温度逐渐降低至接近气温。在自然堆肥过程中,紫茎泽兰物料无明显的高温期。成组数据统计分析表明，生物堆肥的温度高于气温的时间有34 d；在堆制第10～50天，平均温度比自然堆肥高20.88 ℃；自然堆肥高于气温的时间有14 d，最高39 ℃。

在生物堆肥处理中，紫茎泽兰的石油醚提取物持续大幅度降低(图2)。其中，0～20 d 的降幅度最大，20 d 后缓慢降低至0.37 g/kg。在自然堆肥处理中,紫茎泽兰的石油醚提取物缓慢小幅度降低。成组数据统计分析表明，自然堆肥的石油醚提取物显著高于生物堆肥。堆制到第80天，自然堆肥的石油醚提取物是生物堆肥的57.5倍。

图1 堆肥过程中堆肥温度的变化Fig.1 Changes of temperature in composts

图2 堆肥过程中石油醚提取物的变化Fig.2 Changes of petroleum ether extracts in composts

2.2 堆肥的外观变化与质量

随堆肥时间的延长，生物堆制的紫茎泽兰逐渐由绿色转变为褐色、黑褐色、黑色,体积缩小。在堆制到第80天时,紫茎泽兰呈黑褐色和黑色，质地松软，臭味消失，完全腐熟。但是，在自然堆肥处理中，紫茎泽兰呈灰色或灰褐色，绝大多数形态完好，质地坚硬，难于折断，仍有紫茎泽兰特有的恶臭气味，腐熟不佳。

表1可见，自然堆肥的水分、有机质和总养分依次为58.47%、41.42%和5.07%，均未达到NY/525-2011国家标准。生物堆肥的水分、有机质、总养分依次为73.28%、55.32%和6.18%；铅、镉、砷、汞、铬含量分别是13.25、0.61、3.54、0.26和18.14 mg/kg；除水分含量之外，各项指标均符合国家标准。生物堆肥的有机质、N、P2O5、K2O含量显著高于自然堆肥，腐殖酸含量高达8.42%。

表1 紫茎泽兰的水分、有机质、pH、氮、磷、钾、腐殖酸及重金属含量Table 1 Water,organic matter,pH,nitrogen,phosphorus,potassium,humic acids and heavy metals in A.adenophora

表中数据为平均数±标准差。数据后有不同字母者表示差异显著(LSD法检验，P<0.05)。下同。
Data are mean±SD.Different letters indicate significant difference atP<0.05 by LSD test.The same below.

2.3 紫茎泽兰堆肥的动物毒性

用生物堆制的紫茎泽兰灌胃给药，在第1，2，3，7和14天，试验组和对照组的小鼠体重增长无显著差异。在试验期间，对照组(蒸馏水灌胃给药)的小鼠体重从21.33 g增加至24.32 g，试验组的小鼠体重从21.85 g增加至24.57 g(表2)，供试动物的外观和行为均无异常。此外，在试验结束后，对全部小鼠进行了大体解剖，其心、肝、肾、肠等组织器官未出现体积、颜色、质地等改变。

表2 腐熟紫茎泽兰提取液对供试小鼠体重的影响Table 2 Influence of water extraction from A.adenophora on the weight of test mice g

2.4 紫茎泽兰堆肥小麦种子发芽和幼苗生长的影响

表3可见，用生物堆肥浸提液浸种，显著提高小麦种子的发芽指数和活力指数，促进幼苗生长，分别比无离子水浸种提高8.65%(发芽指数)、28.79%(活力指数)、23.69%(苗高)和27.41%(最大根长)。相反，新鲜和自然堆制的紫茎泽兰则抑制种子发芽和幼苗生长，前者的抑制作用大于后者。

表3 紫茎泽兰提取液对小麦种子发芽的影响Table 3 Effect of water extraction from A.adenophora on seed germination and seedling growth of wheat

2.5 紫茎泽兰堆肥对土壤微生物碳、氮和脱氢酶活性的影响

土壤微生物碳、氮和脱氢酶活性均以紫茎泽兰生物堆肥处理最高，化肥次之，不施肥最低(表4)。在添加紫茎泽兰堆肥的土壤中，微生物碳、氮和脱氢酶活性分别比对照提高1.97，1.07和1.85倍，比施用化肥增加97.30%、30.05%和84.33%。

表4 施用紫茎泽兰堆肥对土壤微生物碳、氮和脱氢酶活性的影响Table 4 Fertilization of A.adenophora compost on microbial carbon,nitrogen and dehydrogenase activity

3 讨论

堆肥是微生物主导下的生物化学过程，有机物料在堆制过程中发生矿质化和腐殖化。工厂化处理紫茎泽兰生产有机肥需要运输、固定投资和运行成本，亏损严重。在自然堆制紫茎泽兰的过程中，升温缓慢，无明显高温期，说明紫茎泽兰的毒物抑制微生物活动，妨碍堆肥生物化学反应，导致腐熟效果欠佳，难于有效杀灭根、茎和种子等繁殖器官，不能施入土壤。相反，在生物堆肥处理中，腐熟剂中的铜绿假单胞菌能分解苯、菲和芘等，这些芳香族毒物易溶于石油醚，故石油醚提取物持续大幅度降低，有益于微生物活动，促进有机质矿化腐熟。就普通堆肥而言，一般3～4 d进入高温期[29]，而紫茎泽兰生物堆肥需要16 d，间接证明紫茎泽兰具有微生物毒性，恶臭假单胞菌具有分解这些毒物的作用，添加腐熟剂很有必要。

温度、水分、pH、物料等与微生物活动和堆肥质量密切相关[30]。在生物堆肥处理中,接种热解纤维梭菌增加了矿化微生物数量；添加尿素降低紫茎泽兰的碳氮比,满足微生物的氮素营养需要；硫酸钙与有机质分解释放的CO2和NH3分别生成硫酸铵和碳酸钙，可减少氨的挥发损失，有益于提高堆肥质量；盖膜可保持物料温度相对平稳，防止降雨积水，减小环境条件的不良影响。因此，生物堆肥有益于微生物活动，促进堆肥发酵。此外，堆肥温度提高是有机质矿化释放热量并逐渐积累的结果，也是微生物活跃的表现。紫茎泽兰生物堆肥的高温期(≥50 ℃)持续21 d，最高温度64.5 ℃，类似张建峰等[31]、张旭等[32]和党秋玲等[33]对普通堆肥的研究结果。在堆肥的高温阶段,有机质迅速矿化并脱水；降温期主要进行腐殖化作用,二者均是堆肥发酵生产有机肥的关键时期[34]。在生物堆肥的处理中，较长时间的高温期不仅有益于有机质矿化和物料脱水，而且还能有效杀灭紫茎泽兰的各种繁殖器官；降温后进行腐殖化反应，形成腐殖质，改善堆肥质量。故在紫茎泽兰堆肥结束后，有机质、氮、磷、钾、腐殖酸含量显著高于自然堆肥，并呈黑褐色和松软状态,腐熟良好，堆肥质量达到国家NY/525-2011标准(水分例外)，腐殖质含量高达8.42%。相反，在自然堆肥的处理中,紫茎泽兰碳氮比高，微生物毒物质分解缓慢，气温和降雨直接影响物料的温度和含水量，均不利于微生物活动，故无明显的高温期，腐熟不佳。

紫茎泽兰具有动物毒性，给畜牧业造成巨大危害[35-36]。在动物急性毒性试验中，小鼠一日内灌胃给予腐熟紫茎泽兰浸提液60 mL/kg，达到该动物的最大给药量。饲养14 d的结果表明，供试动物的外观、行为、体重均无异常，心、肝、肾、肺、肠等脏器的体积、颜色、质地等也未出现病理变化，说明生物堆制的紫茎泽兰对动物安全无害。此外，新鲜紫茎泽兰的浸提液抑制小麦种子发芽，地上部和根系生长，与前人研究类似[37]。自然堆制紫茎泽兰80 d，其浸提液仍有抑制作用，尚未消除化感作用；相反，经生物堆制之后，紫茎泽兰浸提液促进小麦种子发芽和幼苗生长，说明生物堆肥有效降解了化感物质，与王亚麒等[38]和焦玉洁等[10]的研究结果相似。生物堆肥的腐殖酸含量高达8.42%(干基)，这可能是促进小麦种子发芽和幼苗生长的重要原因之一。值得注意的是，在添加紫茎泽兰生物堆肥的土壤中，微生物碳氮含量提高，说明其数量增加。土壤脱氢酶仅存于活细胞内，通过催化电子和质子转移而氧化有机质，是土壤微生物新陈代谢的重要标志之一[39]。与不施肥和单施化肥相比，紫茎泽兰有机肥提高土壤脱氢酶活性，意味着土壤微生物活性增强。

4 结论

生物堆肥能野外就地腐熟紫茎泽兰，降解对动物、植物和土壤微生物有毒的化学物质，促进小麦种子发芽和幼苗生长，有机肥符合国家NY/525-2011标准(含水量例外)。因此，生物堆肥处理紫茎泽兰可提供有机肥源，实现紫茎泽兰的经济、有效防除与资源化利用。

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Microbial composting and detoxification ofAgeratinaadenophora

YANG Hong-Jun1,DU Ru-Wan2,WU Ye-Kuan2,WAN Jian2,WANG Yong2,ZHAO Jiang3,LIANG Yong-Jiang3,ZHANG Chang-Hua3,YUAN Ling1*

1.CollegeofResourceandEnvironment,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China；2.LiangshanTobaccoCompanyofSichuanProvince,Xichang615000,China；3.ZunyiTobaccoCompanyofGuizhouProvince,Zunyi563000,China

Ageratinaadenophora,the most harmful invasive plant in China,is toxic to animals,plants,and microbes.This paper describes work to develop a technique for compostingA.adenophorainsituand evaluation of the decomposition effect to provide information on the effective elimination and resource utilization of this harmful plant.This study investigated the composting ofAgeratinaadenophorausing incubation with Pseudomonas putita,Clostridium thermocellum,addition of urea and CaSO4,and covering the stack with plastic film.Biological toxicity was evaluated at the end of bio-composting.The high temperature period (50.0-64.5 ℃) lasted for 22 days and detection of toxin in petroleum ether extracts decreased from 3.15 g/kg to 0.37 g/kg.After 80 days of bio-composting,andA.adenophoraplant material was well decomposed.The compost contained 8.42% humic acids.The pH,organic matter and heavy metal concentrations of the compost matched the NY/525-2011 state standard.No effects on growth in wheat were detected following gavage ofA.adenophoracompost extract (ACE) with a large amount of water.Similarly,no pathologic changes in the main organs (heart,liver,kidney and lungs,mice) were detected either.Wheat seed germination,seedling vigor index and seedling height were increased by 8.65%,28.79% and 23.69%,respectively compared with control (water soaked) seeds,when seeds were soaked seeds with ACE.In an incubation experiment,addition of bio-compost into soil increased microbial biomass carbon and nitrogen,and dehydrogenase activity compared with with untreated soil used as a control or soil which had

a chemical fertilizer treatment.This indicates that ACE promoted microbial growth,reproduction,and activity of soil.In summary,bio-composting successfully decomposed and detoxifiedA.adenophoraherbage,and was able to produce organic fertilizer for agriculture,thereby effectively and economically eliminating and utilizing this invasive plant.

Ageratinaadenophora；microbial compost；effect；toxicity evaluation

10.11686/cyxb2016308 http://cyxb.lzu.edu.cn

杨红军,杜如万,吴叶宽,王剑,王勇,赵建,梁永江,张长华,袁玲.紫茎泽兰野外微生物堆肥及毒性评价.草业学报,2017,26(6):131-138.

YANG Hong-Jun,DU Ru-Wan,WU Ye-Kuan,WAN Jian,WANG Yong,ZHAO Jiang,LIANG Yong-Jiang,ZHANG Chang-Hua,YUAN Ling.Microbial composting and detoxification ofAgeratinaadenophora.Acta Prataculturae Sinica,2017,26(6):131-138.

2016-08-18；改回日期：2016-11-04

国家重点基础研究发展计划项目(2013CB127405)，四川省烟草公司凉山州公司科技项目(2015)和贵州省烟草公司遵义市公司科技项目(2011-05)资助。

杨红军(1978-)，男，陕西洛南人，讲师，博士。E-mail:meilirensheng@swu.edu.cn

*通信作者Corresponding author.E-mail:lingyuanh@aliyun.com