LC—MS/MS同时测定大鼠血浆中瑞香素、西瑞香素和瑞香新素及其药代动力学研究

胡伊力格其+曹萨丽+林龙飞+付京+董晓旭+杨春静+张淼+倪健

[摘要] 建立同時测定大鼠灌胃祖师麻提取物后血浆中瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的HPLC-MS/MS分析方法，并用于计算3个成分在大鼠体内的药代动力学参数。试验采用6只SD大鼠，口服给予祖师麻提取物 （瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的给药量分别是88.40，3.24，4.28 mg·kg^-1），以五味子醇甲为内标，用LC-MS/MS测定给药后血浆中药物浓度，绘制血药浓度-时间曲线，并用Kinetica 4.4软件计算相关药代动力学参数。试验结果显示，瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的线性范围均为5～1 000 μg·L^-1，方法学考察符合要求。日内、日间变异系数（RSD）均小于15%，精密度和准确度符合生物样品分析要求。瑞香素、西瑞香素和瑞香新素口服给药后的Tmax分别为4，2.92，2 h； Cmax分别为858.96，178.00，36.67 μg·L^-1；AUC0-t分别为10 566.4，905.89，355.11 μg·L^-1·h； 半衰期t1/2分别为5.19，3.50，4.95 h；平均驻留时间MRT分别为9.43，6.95，8.27 h。因此，该研究建立的LC-MS/MS分析方法准确灵敏，适于对SD大鼠口服祖师麻提取物后的瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的药代动力学研究。

[关键词] LC-MS/MS； 祖师麻； 瑞香素； 西瑞香素； 瑞香新素； 药代动力学

[Abstract] To establish HPLC-MS/MS method for simultaneous determination of daphnetin， daphnoretin， and daphneticin in rat plasma after oral and intravenous administration of Daphne giraldii extract， and then use them in the calculation of pharmacokinetic parameters. Six sprague-dawley rats received intragastric administration of D. giraldii extract （daphnetin， daphnoretin and daphneticin were 88.40， 3.24 and 4.28 mg·kg， respectively）. Their drug plasma concentration was determined by LC-MS/MS with schisandrin as an internal standard to draw plasma concentration-time curve. The pharmacokinetic parameters were calculated by Kinetica 4.4. The results showed that the linear range was 5-1 000 μg·L^-1 for daphnetin， daphnoretin and daphneticin， and the method ological test showed conformance to the requirements.The intraday and inter-day variable coefficients （RSD） were both less than 15.0%， indicating that both of legitimate precise and accuracy were consistent with the analysis requirements of biological samples. For daphnetin， the pharmacokinetic parameters Tmax， Cmax， AUC0–t， T1/2 and MRT were 4 h， 858.96 μg·L^-1， 10 566.4 μg·L^-1·h， 5.19 h and 9.43 h， respectively. For daphnoretin， the pharmacokinetic parameters Tmax， Cmax， AUC0–t， T1/2 and MRT were 2.92 h， 178.00 μg·L^-1， 905.89 μg·L^-1·h， 3.50 h and 6.95 h， respectively. For daphneticin， the pharmacokinetic parameters Tmax， Cmax， AUC0–t， T1/2 and MRT were 2 h， 36.67 μg·L^-1， 355.11 μg·L^-1·h， 4.95 h and 8.27 h， respectively. The LC-MS/MS analysis method established in this study was proved to be so accurate and sensitive that it can be applied to the pharmacokinetic study of daphnetin， daphnoretin and daphneticin.

[Key words] LC-MS/MS； Daphne giraldii； daphnetin； daphnoretin； daphneticin； pharmacokinetic

祖师麻为我国民间传统常用中药，长久以来一直用于治疗风寒湿邪侵袭而致的风湿性关节炎、类风湿性关节炎引起的疼痛等相关症状，并取得了良好的效果。根据文献记载瑞香属植物黄瑞香Daphne giraldii Nitsche，凹叶瑞香D. retusa Hemsl，长白瑞香D. koreana，陕甘瑞香D. tangutica Maxim以及同科结香属植物结香 Edgeworthia chrysantha Lindl.均可作为祖师麻入药，入药部位为干燥茎皮及根皮。收载于1977年版《中国药典》[1]一部。近年来从祖师麻中分离并鉴定的化合物主要包括香豆素、木脂素类、黄酮类、二萜类等多种化学成分。其中香豆素類成分瑞香素、瑞香新素和西瑞香素等，因其显著的抗炎、镇痛[2-8]、抗肿瘤[9-11]等生物活性而被国内外广泛研究。

通过查阅国内外文献，发现目前有文章报道研究了瑞香素单体不同给药途径在大鼠体内的药代动力学[12]及甘草提取物对瑞香素大鼠体内的药代动力学影响[13]；西瑞香素单体不同给药途径在大鼠体内的药代动力学[14]及其在大鼠体内的组织分布情况[15-17]。但是关于同时测定祖师麻提取物中瑞香素、西瑞香素和瑞香新素3个成分在大鼠体内药代动力学的研究，尚未见任何报道。本文旨在建立高效、灵敏的LC-MS/MS用于测定大鼠口服祖师麻提取物后瑞香素、瑞香新素和西瑞香素的血药浓度，并用于祖师麻提取物在大鼠体内的药代动力学研究。

1 材料

液相色谱串联质谱仪（6460 Triple Quad LC-MS，Agilent Technologies）；XP26型1/1 000电子天平（Mettler Toledo）；3K15型冷冻高速离心机（Sigma，14 000 r·min^-1）；旋蒸浓缩仪（Labconco，60孔）；XW-80A旋涡混合器（江苏海门市麒麟医用仪器厂）；移液枪（Gilson，1 000，200，100，10，2 μL）。

瑞香素对照品（批号110900-201006，纯度98%），购自中国食品药品检定研究院；西瑞香素对照品（批号2548/18557，纯度98%）和五味子醇甲（内标，批号2329/21056，纯度98%），均购自于上海诗丹德生物技术有限公司； 瑞香新素（自制，纯度大于98%）。甲醇和乙腈为色谱纯，购自Fisher Scientific；甲酸，纯度88%，购自赛默飞世尔科技有限公司；水为Cascada Ⅸ超纯水系统，Pall Corporation公司；其他试剂均为分析纯。祖师麻药材由秦皇岛市山海关药业有限责任公司提供，北京中医药大学刘春生教授鉴定为瑞香科植物黄瑞香D. giraldii的干燥茎皮及根皮。

SD大鼠，雄性，体重（250±20）g，合格证号SCXK（京）2012-0001，购自北京维通利华有限责任公司。

2 大鼠血浆中3种成分的LC-ESI-MS/MS同时测定方法的建立

2.1 色谱条件

Agilent 5 TC-C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流速1 mL·min^-1；检测波长320，344 nm；柱温25 ℃；以0.1%磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱，0～10 min，5%～15% B；10～40 min，15% B；40～50 min，15%～35% B；50～70 min，35% B；70～80 min，35%～95% B；80～81 min，95%～5% B；81～90 min，5% B。

2.2 质谱条件

离子源为电喷雾电离ESI；检测方式为正离子模式；雾化气压力45 psi（1 psi=6.895 kPa）；保护气为氮气，流速10 L·min^-1；干燥气温度350 ℃；毛细管电压4 000 V；离子采集方式为多重反应监测（MRM），其余质谱参数见表1。3个成分以及内标五味子醇甲的质谱图见图1，2。

2.3 标准溶液的配制

分别精密称取瑞香素对照品10.09 mg、西瑞香素对照品10.12 mg、瑞香新素对照品10.05 mg，置于10 mL量瓶中，瑞香素和西瑞香素用85%甲醇、瑞香新素用甲醇定容至刻度，配制成瑞香素、西瑞香素、瑞香新素质量浓度分别为1.009，1.012，1.005 g·L^-1的标准储备液。

精密移取3个标准储备液适量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成分别含有100 mg·L^-1的中间混合标准溶液。再取上述中间混合标准溶液，以适宜溶剂进行系列稀释，依次获得瑞香素、西瑞香素、瑞香新素质量浓度为10，8，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05 mg·L^-1的标准系列工作溶液。

精密称取五味子醇甲对照品10.02 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成质量浓度为1.002 g·L^-1的标准储备液。临用时再用甲醇稀释为1 mg·L^-1的标准工作溶液。

2.4 血浆样品的制备方法

取1.5 mL的洁净EP管，每管加入SD大鼠空白血浆100 μL，每管里依次精密加入质量浓度为10，8，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05 mg·L^-1的标准系列工作溶液10 μL，漩涡混合30 s后分别精密加入质量浓度为1 mg·L^-1的五味子醇甲内标溶液10 μL，漩涡混合30 s，加500 μL甲醇-乙腈（1∶1）溶液沉淀蛋白，漩涡30 s，置14 000 r·min^-1离心机中离心5 min，同法沉淀2次，共得上清液1 000 μL，置旋蒸浓缩仪30 ℃蒸干3 h，蒸干后残渣加入100 μL 20%甲醇-乙腈（1∶1）复溶，漩涡5 min，14 000 r·min^-1离心20 min，取上清，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 方法的选择性 取SD大鼠空白血浆100 μL，按2.4项下进行处理，用LC-MS/MS方法进行分析，获得SD大鼠空白血浆样品的色谱图；取受试SD大鼠口服给予祖师麻提取物后的血浆样品，同法操作，得色谱图，考察分析方法的选择性。结果见图3～6，由图可知，瑞香素、西瑞香素、瑞香新素和内标五味子醇甲的出峰时间分别是4.03，6.62，6.00，8.15 min，待测成分峰形及分离效果较好，SD大鼠血浆中的内源性物质、代谢产物及祖师麻提取物中的其他成分不干扰待测成分的检测。

2.5.2 基质效应 取低、中、高3个浓度的混标溶液与内标溶液混合，测定峰面积值作为纯溶剂样品含量。另取平行6份空白血浆按2.4项下处理后加入低、中、高浓度去除溶剂的混标溶液和内标溶液，制备得标准对照样品，测定峰面积作为基质样品含量，结果见表2。

基质效应=基质样品含量/纯溶剂样品含量×100%

2.5.3 法的线性范围和定量下限 取3个成分质量浓度为5，25，50，250，500，1 000 μg·L^-1，内标质量浓度为100 μg·L^-1的系列标准血浆样品，按2.4项进行血浆样品处理，进样测定，记录峰面积。以待测物的峰面积与内标峰面积比值为纵坐标（Y），血浆中样品的质量浓度为横坐标（X），用加权（W=1/X）最小二乘法进行回归运算得回归方程。瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的标准曲线见表3，3个成分线性范围均为5～1 000 μg·L^-1，相关系数大于0.99，定量下限（LLOQ）为5 μg·L^-1。

2.5.4 方法的准确度和精密度 取定量下限、低、中、高4个血浆浓度（5，10，100，800 μg·L^-1）的QC样品和随行标准曲线，含内标五味子醇甲质量浓度为100 μg·L^-1，按2.4项进行处理，计算方法的准确度和批内及批间精密度，结果符合2015年版《中国药典》规定要求。

2.5.5 提取回收率 取3个成分低、中、高3个质控浓度的血浆样品各6份，按照2.4项进行处理，进样测定，记录峰面积，与未经提取的6份含相同含量3个成分的混合标准液进行比较，计算提取回收率，结果见表4，结果表明3个成分的回收率均大于80.00%，回收率测定的RSD均小于15%，可用于血浆样品中3个成分的分析测定。

2.5.6 稳定性 考察3个成分低、中、高3个质量控制浓度的血浆样品在室温放置24 h，-20 ℃冷冻30 d和-20 ℃反复冻融3次的稳定性。结果表明，3个成分在大鼠血浆中仍可保持稳定。

3 祖师麻提取物中3种成分大鼠体内药代动力学研究

3.1 药物配制

祖师麻药材，粉碎，过筛，加水煎煮3次，第1次2 h，第2次和第3次每次1 h，合并滤液，浓缩，醇沉至75%，放置过夜，过滤，浓缩成流浸膏。每1 mL流浸膏相当的生药量为2.2 g，其中瑞香素的含量约8.840 mg、西瑞香素的含量约0.324 mg、瑞香新素的含量约0.424 mg。

3.2 给药方案

SD大鼠6只，禁食12 h（自由饮水）。每100 g体重灌胃给祖师麻流浸膏1 mL。给药前及给药后分别于0.167，0.25，0.5，1，2，6，8，10，12，24 h眼眶取血，每次取血约0.4 mL，轻晃使与抗凝剂混合均匀，离心10 min，转速6 000 r·min^-1，取上层血浆，置-20 ℃冰箱中备用。

瑞香素、西瑞香素和瑞香新素3个成分的时间-血药浓度曲线见图7。所测数据使用Kinetica 4.4软件进行处理，瑞香素、西瑞香素和瑞香新素3个成分大鼠体内药动学参数见表5。

4 讨论

本研究建立了同时测定SD大鼠血浆中的瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的LC-MS/MS方法，该方法快速、灵敏、准确，血浆中瑞香素、西瑞香素和瑞香新素3种成分的线性范围均在5～1 000 μg·L^-1；精密度和准确度良好，可保证结果的准确性；瑞香素、西瑞香素和瑞香新素低、中、高3个浓度质控样品的提取回收率分别为83.43%～93.07%，86.33%～93.43%，86.10%～96.79%；基质效应在89.10%～109.25%；血浆样品稳定性良好；所建立的試验方法符合定量要求，可用于口服给予祖师麻提取物后其主要成分瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的体内药代动力学研究。

SD大鼠口服给予祖师麻提取物（瑞香素88.40 mg·kg^-1，西瑞香素3.24 mg·kg^-1，瑞香新素4.28 mg·kg^-1）后，瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的达峰时间Tmax分别为4，2.92，2 h；Cmax分别为858.96，178.00，36.67 μg·L^-1；AUC0-t分别为10 566.4，905.89，355.11 μg·L^-1·h；AUC0-∞分别为11 130.80，916.48，369.18 μg·L^-1·h；半衰期T1/2分别为5.19，3.50，4.95 h；平均驻留时间MRT分别为9.43，6.95，8.27 h。

内标物质的选择：为了建立准确合理，有效成分的大鼠血浆测定方法，选择合适的内标物质作参比物质尤为重要。在实验过程中，分别考察了补骨脂素、白藜芦醇和五味子醇甲，结果发现五味子醇甲和瑞香素、西瑞香素、瑞香新素结构相似[27]，色谱峰出峰位置能够和待测物及内源性物质分离，其空白和给药血浆样品中均无干扰，且回收率与基质效应与待测物平行，因此，最终选择五味子醇甲作为瑞香素、西瑞香素和瑞香新素药代动力学考察的内标物质。

样品处理方法的选择：药物进入动物体内之后，经过吸收、分布和代谢，然后排除体外，在血浆样品中除了有原型待测药物之外，还有待测药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物以及待测药物或其代谢物与内源性物质等，因此需要对血浆样品进行前处理后测定血浆样品中的待测药物。本方法学的建立同时考察了甲醇沉淀蛋白、乙腈沉淀蛋白和甲醇-乙腈（1∶1）沉淀蛋白以及液-液萃取，最终发现甲醇-乙腈（1∶1）5倍量沉淀蛋白各2次，基质效应和回收率符合要求。因此最终选择了该样品前处理方法。

药代动力学研究结果表明，3个成分的Tmax在3 h左右，T1/2在5 h左右，MRT在8 h左右，但瑞香素的Cmax和AUC远高于西瑞香素和瑞香新素，可能主要由于瑞香素在祖师麻中含量较高和吸收良好所致。

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[责任编辑 曹阳阳]