二甲双胍对行IVF/ICSI的PCOS患者妊娠结局及子宫内膜容受性的影响

孙东霞 王靖媛 赵哲琪 常梓殷 翟军

(1.郑州大学第一附属医院 生殖医学中心 河南 郑州 450052；2.聊城市人民医院 生殖遗传科 山东 聊城 252000)

二甲双胍对行IVF/ICSI的PCOS患者妊娠结局及子宫内膜容受性的影响

孙东霞1,2王靖媛1赵哲琪1常梓殷1翟军1

(1.郑州大学第一附属医院 生殖医学中心 河南 郑州 450052；2.聊城市人民医院 生殖遗传科 山东 聊城 252000)

目的 探讨二甲双胍对多囊卵巢综合征(PCOS)合并胰岛素抵抗(IR)的不孕患者行体外受精/卵细胞浆内单精子显微注射(IVF/ICSI)的临床结局以及对子宫内膜容受性的影响。方法 将80例需IVF/ICSI助孕的PCOS患者随机分为二甲双胍组(A组)和对照组(B组)，A组患者于月经或撤退性出血的2～5 d开始口服二甲双胍500 mg/次，3次/日，至取卵后第6天，B组不服用二甲双胍。观察比较两组患者辅助生殖的相关参数，同时采集A组和B组中因卵巢过度刺激倾向未移植患者的子宫内膜组织，分别为A1、B1组，应用Western blot检测同源框基因A10(HOXA10)和整合素β3(ITGB3)水平的表达。结果 A、B两组Gn天数及其总量、获卵数、正常受精率、优胚率及子宫内膜厚度差异均无统计学意义(P>0.05)，A组临床妊娠率较B组显著增高(P<0.05)，而HCG日雌二醇水平、周期取消率、流产率和卵巢过度刺激综合征(OHSS)发生率均显著降低(P<0.05)； A1组患者子宫内膜HOXA10和ITGB3蛋白表达水平均高于B1组(P<0.05)。结论 对于PCOS合并IR的不孕患者，二甲双胍治疗可以提高患者IVF/ICSI助孕时的临床妊娠率，降低流产率和OHSS发生率，并改善子宫内膜容受性。

多囊卵巢综合征(PCOS)；二甲双胍；IVF/ICSI；子宫内膜容受性

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄妇女最常见的生殖内分泌和代谢紊乱性疾病之一，发病率高达6%～21%[1-2]。PCOS患者多数伴有胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)。二甲双胍作为胰岛素增敏剂，可降低患者的胰岛素抵抗状态，并可使部分PCOS患者恢复月经甚至诱发排卵而妊娠[3-6]。但对需行体外受精-胚胎移植技术助孕的PCOS患者，是否需要添加二甲双胍治疗，以及二甲双胍治疗后对患者妊娠结局、胚胎质量及子宫内膜容受性等方面的影响如何，目前研究结果尚存争议。

为此，我们对需行体外受精/卵胞浆内单精子显微注射(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection，IVF/ICSI)助孕治疗的PCOS合并IR的不孕患者同时应用二甲双胍治疗，比较二甲双胍组和对照组患者辅助生殖的相关参数，同时比较两组患者子宫内膜容受性的分子标志物同源框基因A10(HOXA10)、整合素β3(ITGB3)的表达情况，探讨体外受精-胚胎移植技术中二甲双胍对PCOS合并IR的不孕患者的作用，以期为临床治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年7—11月于郑州大学第一附属医院生殖医学中心首次需行IVF/ICSI助孕的80例PCOS并IR患者为研究对象，按随机数表法分为二甲双胍组(A组，40例)和对照组(B组，40例)。PCOS的诊断标准参照2003年鹿特丹会议[7]制定。其中，A组患者均于月经或撤退性出血的2～5 d开始，于餐后30 min开始口服二甲双胍500 mg/次、3次/d，至取卵后第6天，B组不服用二甲双胍。1.2 试验方法

1.2.1 激素测定 激素和内分泌相关指标的测定采用全自动化学发光免疫仪器测定血清促卵泡素(follicle stimulating hormone，FSH)、促黄体生产素(luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)、孕激素(progestogen，P)、睾酮雄激素(testosterone，T)、胰岛素(insulin，INS)。氧化酶法测定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)。取卵后第6天再次测定T、INS、FBG的水平。采用稳态模式评估法(Homeostasis Model Assessment，HOMA)评估是否有IR：HOMA-IR=空腹血糖(mmoL/L)×空腹胰岛素(mIU/L)/22.5。若HOMA-IR>2.69则判定为IR[8]。1.2.2 内膜采集 A组和B组中因卵巢过度刺激未移植的患者分为服药A1组和未服药B1组。两组均于取卵后第6天行子宫内膜采集，存于液氮罐保存。采集前患者均签署知情同意书，本研究经郑州大学第一附属医院伦理委员会通过。随机数字表法于两组中各选取3例子宫内膜组织进行下一步实验。

1.2.3 蛋白印迹 液氮罐中取出组织样本，提取总蛋白，Western blot检测子宫内膜组织HOXA10、ITGB3的表达并进行蛋白定量。以每泳道30 mg上样，用10%的SDSPAGE电泳分离蛋白，将蛋白转移到PVDF膜上，室温下50 g/L脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST漂洗10 min，3次，再用HRP标记二抗室温孵育1 h，漂洗10 min，3次后ECL发光显色，用化学发光成像系统分析结果。本实验应用的抗HOXA10抗体和抗ITGB3抗体均购自美国Sigma公司。

1.3 观察指标 ① A、B两组患者IVF/ICSI助孕后Gn天数及用量、HCG日雌激素水平、获卵总数、受精率、优质胚胎数、临床妊娠率及卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)发生率等生殖相关参数；② A组患者内分泌的变化情况；③A1组、B1组PCOS患者子宫内膜HOXA10、ITGB3蛋白水平的表达。

2 结果

2.1 两组患者一般资料和基础内分泌水平的比较 两组患者年龄、不孕年限、BMI、基础FSH、LH、E2、T及HOMA-IR差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 两组患者一般资料及基础内分泌水平比较

2.2 A组患者治疗前后T和HOMA-IR变化情况的比较 A组PCOS患者二甲双胍治疗前后T水平差异无统计学意义(P>0.05)，HOMA-IR治疗后较治疗前明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 A组患者治疗前后T和HOMA-IR比较

2.3 两组患者辅助生殖相关参数的比较 A组患者HCG日E2水平、周期取消率、流产率和OHSS发生率均低于对照组(P<0.05)，临床妊娠率高于对照组(P>0.05)，Gn天数及其总量、获卵数、正常受精率、子宫内膜厚度及优质胚胎率差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两组患者生殖相关参数比较

2.4 两组患者子宫内膜HOXA10和ITGB3蛋白表达水平的比较 Western blot结果显示，A1组PCOS患者子宫内膜组织HOXA10、ITGB3蛋白表达水平高于B1组(P<0.05)。结果详见图1、表4。

图1 A1、B1两组患者子宫内膜HOXA10、ITGB3 western blot条带图

蛋白A1组B1组PHOXA100.85±0.040.56±0.070.004ITGB31.03±0.030.45±0.200.008

3 讨论

PCOS发病机制至今尚未阐明，目前认为IR及其继发的高胰岛素血症是PCOS病理生理的中心环节[9-10]。二甲双胍因体外研究证实无致畸作用在PCOS患者治疗中应用最为广泛，多数研究证实了二甲双胍治疗PCOS患者的有效性，包括可降低PCOS患者高胰岛素水平，使部分患者恢复月经周期和排卵，并显著降低早期流产率。但在辅助生殖技术中，联合二甲双胍治疗能否提高妊娠率，改善妊娠结局，目前尚存争议。Tso等[11]研究结果显示，在IVF中联合应用二甲双胍治疗，临床妊娠率及活产率无明显提高。Kjotrod等[12]研究认为，二甲双胍组临床妊娠率、活产率较对照组显著增加，而其他生殖相关参数无显著差异。本研究结果显示，二甲双胍组PCOS患者的临床妊娠率高于对照组(56.8%比36.4%，P<0.05)，流产率低于对照组(9.1%比25.0%，P<0.05)，但两组患者的受精率、优质胚胎率无明显差异(P>0.05)，提示二甲双胍可能通过改善子宫内膜的容受性而改善临床妊娠结局。

子宫内膜容受性是指子宫内膜允许胚胎黏附、侵入并诱导内膜间质发生一系列变化，最终使胚胎植入内膜的能力。研究显示，PCOS患者胚胎着床期胞饮突、HOXA10、整合素β3、白血病抑制因子(LIF)、子宫内膜及内膜下血流等子宫内膜容受性标志物均降低[13-14]。子宫内膜组织为胰岛素作用的靶器官之一，PCOS患者的IR和高胰岛素血症可以通过诸多途径影响到子宫内膜组织，降低子宫内膜细胞增殖、分化的能力，使内膜容受性受损，从而导致着床困难或受孕后易流产。前期研究也显示PCOS患者子宫内膜存在IR，二甲双胍治疗后子宫内膜组织的葡萄糖转运蛋白-4水平增加，提示子宫内膜组织对葡萄糖的利用增加[15]。据此推测二甲双胍可能通过增强组织对葡萄糖的利用，提高组织代谢水平而改善子宫内膜容受性。

随后对IVF/ICSI中因OHSS倾向未移植的PCOS患者进行子宫内膜采集，用Western blot检测二甲双胍组及对照组子宫内膜组织HOXA10、ITGB3蛋白水平，HOXA10及ITGB3是目前被公认的代表子宫内膜容受性的分子表达物。研究结果显示，二甲双胍组HOXA10、ITGB3蛋白水平高于对照组，证实了二甲双胍对子宫内膜容受性的改善作用。林丹等[16]对40例伴有胰岛素抵抗的PCOS患者进行二甲双胍治疗，结果也显示了二甲双胍组PCOS患者ITGB3的表达高于对照组，认为二甲双胍可改善PCOS患者子宫内膜容受性。但是，二甲双胍究竟通过何种机制影响HOXA10、ITGB3的表达从而改善PCOS患者子宫内膜容受性，目前尚不明确，有待进一步深入研究。

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Influence of metformin on pregnancy outcomes and endometrial receptivity of patients with PCOS undergoing IVF/ICSI treatment

Sun Dongxia1,2, Wang Jingyuan1, Zhao Zheqi1, Chang Ziyin1, Zhai Jun1

(1.Department of Reproductive Medicine, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China; 2.Department of Reproductive Genetics, Liaocheng People’s Hospital, Liaocheng 252000, China)

Objective To explore the influence of metformin on pregnancy outcomes and endometrial receptivity of polycystic ovary syndrome (PCOS) infertile women with insulin resistance (IR) undergoing in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection (IVF/ICSI). Methods PCOS patients who underwent IVF/ICSI were divided into metformin group (group A) and control group (group B). Patients in group A

metformin with a dose of 500 mg tid from the second to fifth day of menstrual period or with drawal bleeding until the sixth day of ovum pick-up (OPU), and no metformin was provided for group B. The reproductive parameters of group A and B were compared. Endometrial tissue were from PCOS patients who were cancelled for the high risk of ovarian hyperstimulation syndrome (OHSS) in IVF/ICSI. Endometrial tissue were divided into group A1(n=3) and B1 group (n=3), and western blot was used to detect the expression of HOXA10 and ITGB3. Results There was no significant difference of two groups in the number of days of Gn and its total, number of oocytes retrieved， normal fertilization rate, excellent embryo rate and endometrial thickness (P>0.05). The clinical pregnancy rate of group A was significantly higher than that of group B(P<0.05). Meanwhile, the E2 level on HCG day, cycle cancellation rate, miscarriage rate and the incidence of OHSS in group A were significantly lower than that of group B (P<0.05). The levels of HOXA10 and ITGB3 expression in A1 group were significantly higher than that of B1 group (P<0.05). Conclusion For PCOS infertility patients with IR in IVF/ICSI, metformin pretreatment can improve clinical pregnancy rate, reduce abortion rate and OHSS incidence, and improve endometrial receptivity.

polycystic ovarian syndrome; metformin; IVF/ICSI; endometrial receptivity

河南省省部共建项目(201601006)；河南省自然科学基金

翟军，E-mail：bestzhai2005@163.com。

R 711

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.09.002

2017-02-01)

项目(162300410310)。