槟榔内生真菌的分离与初步鉴定

宋薇薇,牛晓庆,余凤玉,朱 辉,唐庆华,覃伟权

(中国热带农业科学院 椰子研究所,海南 文昌 571339)

槟榔内生真菌的分离与初步鉴定

宋薇薇,牛晓庆,余凤玉,朱 辉,唐庆华,覃伟权*

(中国热带农业科学院 椰子研究所,海南 文昌 571339)

为了解槟榔内生真菌的多样性,采用组织块培养法从槟榔根、叶、花中分离纯化得到47株内生真菌,同时对这些菌株进行了rDNA-ITS序列扩增和系统发育分析。结果表明:所得内生真菌分属于8个属,包括青霉属(Penicillium)、镰孢属(Fusarium)、叶点霉属(Phyllosticta)、弯孢霉属(Curvularia)、黑孢属(Nigrospora)、炭疽菌属(Colletotrichum)、枝顶孢属(Acremonium)和突脐蠕孢属(Exserohilum)。其中,青霉属(Penicillium)和镰孢属(Fusarium)为优势菌属,这2个属的内生菌株数分别占分离菌株总数的31.91%和27.66%。

槟榔;内生真菌;分离；鉴定; rDNA-ITS序列;系统发育分析

槟榔(ArecacatechuL.)为棕榈科(Palmaceae)槟榔属(Areca)常绿乔木,原产于东南亚,主产于印度、巴基斯坦、马来西亚、印度尼西亚、泰国和中国等国家。在我国,槟榔产区主要集中在海南省,产量约占总产量的95%以上(未计中国台湾省)。除作为热带园林绿化树种外,槟榔还具有重要的药用价值,位居中国四大南药(槟榔、砂仁、益智、巴戟)之首,其果实、种子、皮、花均可入药。目前,槟榔产业已成为海南省仅次于橡胶的第二大支柱产业,是农业产业结构调整中主要的栽培作物之一,发展前景十分广阔[1-2]。经国家批准,槟榔在海南省被列入生态经济林树种,主要分布于海南省东部、中部和南部山区。

植物内生菌是一类生活于植物组织、器官内部的微生物,其生活史的一定阶段或全部阶段在健康植物的各种组织、器官的活细胞内或细胞间隙完成,属于植物组织内的正常菌群。被内生菌感染的宿主植物不表现出外在病症,可通过组织学方法从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生[3]。内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中,并与寄主协同进化,在演化过程中形成了互利共生关系。研究表明,感染内生菌的植物宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抗动物危害等优势,比未感染植株更具有生存竞争力[4]。现已在多种灌木、草本植物、栽培作物、果树、苔藓和蕨类植物中发现并分离了大量内生菌。目前,关于槟榔的研究主要集中在其自身化学有效成分等方面,而有关槟榔内生菌分离鉴定的研究报道很少。Liu A R等[5]在研究海南内生拟盘多毛孢属真菌时,从槟榔树中分离到1株Pestalotiopsisphotiniae(石楠拟盘多毛孢)。谢颖等[6]在筛选香蕉枯萎病拮抗内生菌时,从槟榔组织中分离到8株内生菌,其中真菌6株、细菌2株,但未做菌株鉴定。为了发掘更多的内生菌资源,我们对槟榔的内生真菌进行了分离鉴定,初步探讨了其多样性,以期为槟榔内生菌在植物病害防治中的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 槟榔材料 自万宁市三更罗镇槟榔园采集健康、无病虫的槟榔根、叶、花组织,用于内生真菌的分离。

1.1.2 主要试剂和仪器 真菌基因组DNA提取试剂盒、PCR MasterMix购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio);其它试剂均为国产或进口分析纯试剂。PCR仪为Takara PCR Cycler Dice TP650;核酸电泳仪为北京六一仪器制造厂产品;离心机为Eppendorf公司生产的Sentrifage5810;凝胶成像系统为美国Gene公司的产品。

1.1.3 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar, PDA)培养基:马铃薯200 g、葡萄糖 20 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL, pH自然；于121 ℃下灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离和纯化 取健康槟榔的根、叶、花样品，用自来水冲洗干净,晾干备用。采用组织块分离法,分离时将各组织剪成2 cm左右的小段,然后按常规无菌操作进行表面消毒:用75%酒精浸泡1～2 min,用0.1%升汞消毒3～5 min,用无菌水冲洗4～5次,用灭菌滤纸吸干多余水分,最后用无菌解剖刀将材料切成约0.5 cm× 0.5 cm的小块。将上述组织块置于PDA平板培养基上,在25 ℃下恒温培养。将最后一次冲洗组织块后的无菌水作为对照,以验证消毒效果[7-8]。

待组织块边缘长出菌丝后,挑取边缘菌丝转接到新鲜的PDA培养基上,待菌落长成后,再挑取边缘菌丝进行转接；如此反复纯化4～5次后,转接到PDA斜面上,在4 ℃下保藏备用。

1.2.2 内生真菌DNA的提取和rDNA-ITS序列的扩增 采用真菌基因组DNA提取试剂盒,提取菌株的总DNA。以提取的总DNA为模板,采用真菌rDNA-ITS区通用引物进行PCR扩增。引物序列为ITS1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)和ITS2(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)。PCR反应体系(50 μL):2×MasterMix 25 μL、ITS1(10 μmol/L) 2.5 μL、ITS2(10 μmol/L) 2.5 μL、DNA模板2.5 μL,用ddH2O补足至50 μL。PCR扩增条件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃ 10 min,10 ℃ 5 min。

1.2.3 内生真菌rDNA-ITS序列测定及系统发育分析 PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,将检测到目的条带的样品送往上海生物工程技术服务公司进行测序。

将所得各菌株的rDNA-ITS序列在GenBank核酸序列数据库中进行BLAST比对分析,寻找相似性较高的序列,进行菌株鉴定。进一步选取分离所得的不同属的内生真菌,下载其在GenBank中最相近的同源序列。将菌株的rDNA-ITS序列用ClustalX 2.1软件进行多序列比对并匹配排序；应用MEGA 5.1软件,采用邻接法(Neighbour-Joining method),以1000为重复值进行Bootstrap检验,构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 槟榔内生真菌的分离结果

通过分离纯化,从健康槟榔组织中共获得内生真菌47株,其中,来源于根、叶、花的内生真菌菌株分别为10、31、6株,见图1。对照平板经25 ℃培养5～7 d后,培养基上无明显菌落长出,表明试验材料表面已消毒彻底。

2.2 菌株rDNA-ITS序列的扩增与测序

对分离出的槟榔内生真菌进行DNA提取及rDNA-ITS序列PCR扩增,1.0%琼脂糖凝胶电泳显示,扩增序列条带在600 bp左右,见图2。PCR产物经凝胶电泳检测后,直接送往上海生工测序。47株槟榔内生真菌均获得了测序结果。

2.3 槟榔内生真菌的鉴定

经过测序,将所获得的47株槟榔内生真菌rDNA-ITS片段和GenBank中的已知序列进行BLAST比对,查找与其同源性较高的菌株,最终确定槟榔内生真菌属于8个属,分别为青霉属(Penicillium)、镰孢属(Fusarium)、叶点霉属(Phyllosticta)、弯孢霉属(Curvularia)、黑孢属(Nigrospora)、炭疽菌属(Colletotrichum)、枝顶孢属(Acremonium)和突脐蠕孢属(Exserohilum),表明槟榔内生真菌具有一定的生物多样性。结果见表1。

由表1可见:在所分离的47株槟榔内生真菌中,青霉属(Penicillium)和镰孢属(Fusarium)为优势菌属,分别占分离菌株总数的31.91%和27.66%;其次是叶点霉属(Phyllosticta),占总株数的21.28%;而枝顶孢属(Acremonium)和突脐蠕孢属(Exserohilum)各只有1株,均只占总株数的2.13%。

2.4 槟榔部分内生真菌系统发育树的构建

选取BLJ-1、BLJ-16、BLJ-29、BLJ-39、BLJ-42、BLJ-44、BLJ-46、BLJ-47共8株来源于不同属内生真菌的rDNA-ITS序列及在GenBank中与其同源性最高的序列(表2),采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树,结果见图3。

如图3所示,选取的菌株均与其在GenBank中的同源菌株同处系统发育树的一个分支,遗传距离很近,表明这8株内生真菌可以归类到Fusarium、Acremonium、Colletotrichum、Nigrospora、Curvularia、Exserohilum、Penicillium和Phyllosticta。此外,FusariumBLJ-16和AcremoniumBLJ-46，CurvulariaBLJ-39和ExserohilumBLJ-47，PenicilliumBLJ-1和PhyllostictaBLJ-29这3对不同属的真菌序列间分别显示了较高的一致性,可能来源于遗传距离较近的类群。

表1 槟榔内生真菌的鉴定结果

注:分离比例指分离纯化的菌株占全部分离菌株的百分比。

图1 部分槟榔内生真菌在PDA培养基上的菌落形态

菌株编号片段长度/bp同源菌株序列号一致性/%BLJ-1581Penicilliumsp.FJ008995.199BLJ-16569FusariumoxysporumKJ562373.199BLJ-29649PhyllostictaaloeicolaKR183768.198BLJ-39598Curvulariasp.JQ783059.199BLJ-42561NigrosporasphaericaKM921666.199BLJ-44586ColletotrichumgloeosporioidesKT390195.1100BLJ-46581AcremoniumsclerotigenumKT878352.199BLJ-47613Exserohilumsp.JN207305.199

3 结论与讨论

近年来,植物内生菌由于能够产生丰富多样的具有农药活性的次生代谢产物,在自然界中具有重要的生态学作用,不仅可以为植物提供所需要的营养物质,还参与植物的防卫功能,可以增强植物的抗逆境、抗病害能力,因此已经成为当前研究的一大热点。

内生菌普遍存在于各种水生和陆生植物中,表现出丰富的群落多样性。通常,从1种植物中可分离到的内生菌为数种至数十种,有的甚至多达数百种。Melnick等[9]从可可的叶、果荚、枝和花中分离获得69株内生细菌,划分为5属15个种群。郑艳等[10]分离得到内生菌129株,其中内生真菌4属、6种、58株,优势属为镰刀菌属(Fusarium);内生细菌3属、9种、71株,芽孢杆菌属Bacillus为优势属。有关研究发现,内生菌在植物根、茎、叶、花、果实、种子等组织和器官内均有分布,其分布情况取决于宿主植物本身以及内生菌的种类,在宿主植物不同器官的分布存在差异[4,11]。为了揭示槟榔内生真菌的多样性,本研究通过分离和鉴定,从槟榔根、叶和花中共得到47株槟榔内生真菌,其中大部分菌株来源于叶部,共31株,而从根、花中分别只获得10株和6株；初步将分离的槟榔内生真菌菌株归类到8个属,即青霉属(Penicillium)、镰孢属(Fusarium)、叶点霉属(Phyllosticta)、弯孢霉属(Curvularia)、黑孢属(Nigrospora)、炭疽菌属(Colletotrichum)、枝顶孢属(Acremonium)和突脐蠕孢属(Exserohilum)。其中,青霉属(Penicillium)和镰孢属(Fusarium)为优势内生真菌属。以上结果表明,槟榔中内生真菌存在着较为丰富的生物多样性,它们可能是槟榔内生菌的重要组成部分。本研究结果不但丰富了槟榔内生菌资源,也为今后槟榔内生菌的进一步开发利用提供了理论参考。

M: DL2000 Marker; 1～10:部分内生真菌rDNA-ITS序列扩增条带。

图2 槟榔部分内生真菌rDNA-ITS序列的PCR产物电泳图谱

图3 基于rDNA-ITS序列构建的部分槟榔内生真菌的系统发育树

由于内生菌在植物体内普遍存在,其种类和数量常受到地域、品种、采样时期、采样部位、培养基等因素的影响，因此本研究只采集了槟榔的根、叶和花进行内生真菌的分离,采集样本数量和采样地点均有限,分离的内生真菌种类可能会受到一定的限制,这也可能是本研究未分离到拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)真菌[5]的原因之一。此外,有些内生菌不能在人工培养基上生长或对培养基具有选择特异性；本实验以PDA培养基为分离纯化培养基,可能造成某些内生菌株未被分离出来[6,12]。总的来说,本研究结果在一定程度上反映了槟榔内生菌的多样性。今后有必要增加采样点、采样部位、培养基种类等来获得更多的内生菌资源；而关于槟榔优势内生菌的功能等方面也有待于今后进一步研究。

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(责任编辑:黄荣华)

Isolation and Preliminary Identification of Endophytic Fungi from Arecanut (Arecacatechu)

SONG Wei-wei, NIU Xiao-qing, YU Feng-yu, ZHU Hui, TANG Qing-hua, QIN Wei-quan*

(Coconut Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wenchang 571339, China)

In order to understand the diversity of endophytic fungi in arecanut (ArecacatechuL.), we used tissue block culture method to isolate and identify 47 endophytic fungal strains from the root, leaf and flower of arecanut, amplified the rDNA-ITS sequence of these strains, and constructed their phylogenetic tree. The results showed that the obtained 47 endophytic fungal strains belonged to 8 genera, includingPenicillium,Fusarium,Phyllosticta,Curvularia,Nigrospora,Colletotrichum,AcremoniumandExserohilum. Among these genera,PenicilliumandFusariumwere the dominant genera, and the endophytic fungal strains in these 2 genera accounted for 31.91% and 27.66% of total isolated strains, respectively.

Arecanut; Endophytic fungi; Isolation; Identification; rDNA-ITS sequence; Phylogenetic analysis

2017-02-22

海南省自然科学基金项目“内生菌对槟榔黄化病发生危害的影响”(314144);海南省重点研发计划项目“槟榔拮抗内生菌 资源的筛选与利用”(ZDYF2016058)。

宋薇薇(1981─),女,助理研究员,博士,从事热带经济作物病害生物防治研究。*通讯作者:覃伟权。

S792.91

A

1001-8581(2017)06-0066-04