一种马铃薯块茎蛾卵的计数新方法

吴 梅,刘 燕,李庭喜,段 平,肖 春*

(1.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；2.云南中医学院 中药学院，云南 昆明 650500)

一种马铃薯块茎蛾卵的计数新方法

吴 梅1,2,刘 燕1,李庭喜2,段 平2,肖 春1*

(1.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；2.云南中医学院 中药学院，云南 昆明 650500)

为了解决常规马铃薯块茎蛾卵计数过程中存在的工作量大、卵聚集程度高时计数不准确等，建立了一种新的卵粒计数方法，即采用70%乙醇浸泡卵30 min，用毛笔轻轻刷下，再置于显微镜下计数。经过方法学考察，洗脱计数法的准确性高、精密度、重复性好、操作简便，可用于马铃薯块茎蛾卵粒的计数。

马铃薯块茎蛾；卵粒；计数方法

马铃薯块茎蛾[Phthorimaeaoperculella(Zeller)]又名烟草潜叶蛾，属鳞翅目，麦蛾科(以下简称PTM)。原产于南美洲，目前已发展成为一种世界性害虫，在我国也扩展到西南、西北、中南、华东10余个省、自治区，且发生较为普遍[1-2]。

云南农业大学植保学院是我国较早开展PTM防治研究的单位之一，本实验室已有成熟的PTM人工续代饲养方法，为相关科研工作提供充足的虫源。在实验过程中，经常需要对PTM产卵量进行计数。PTM的卵椭圆形，微透明，卵的平均长、宽分别为(0.40±0.02) mm和(0.30±0.01) mm，初产时乳白色，孵化前变成黑褐色。由于卵粒较小，需要在显微镜下观察计数，而PTM单雌产卵量可达150～200粒[3]，使得卵的计数工作量很大、耗时较长。此外，PTM产卵的习性，如常出现卵聚集、叠压的情况，在马铃薯块茎上多产于芽眼、破皮下或缝隙中，隐蔽性较强。在实验过程中除了在马铃薯、滤纸上产卵，还会在容器壁等处产卵等，上述情况使得用常规直接计数方法既不易也很难保证其准确性。鳞翅目昆虫产卵分泌物的基本功能是包裹卵并将卵固定，分泌物成分复杂，主要是水，还有蛋白质、游离氨基酸、碳水化合物等[4-5]。本研究旨在寻找一种新的准确性高、精密度及重现性好、简便易行的方法，确保实验数据准确并达到减少工作量目的。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试虫卵 马铃薯块茎蛾饲养于云南农业大学植物保护学院养虫室，饲养条件为：(27±2) ℃，相对湿度50%～70%，L/D=14 h/10 h。收集成虫于1 L玻璃烧杯中，喂以10%蜂蜜水，杯口用24目纱网封口，上置滤纸，用以收集虫卵。

1.1.2 仪器与试剂 显微镜：XTL-2400(梧州奥卡光学仪器有限公司)。乙醇、无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、石油醚(30～60 ℃)均为化学纯，蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 溶剂及浸泡时间的选择

1.2.1.1 预实验 将产有卵的滤纸浸泡于水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、石油醚等不同溶剂中，用毛笔轻轻刷拭，只有乙醇可将卵洗下，故选择乙醇作为供试溶液。

1.2.1.2 溶剂及处理时间的选择 溶剂选择了3个浓度的乙醇溶液，分别为无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇；浸泡时间考察了10、30、60 min。将产有卵的滤纸置显微镜下观察，直接数卵粒的数量(即直接计数)。再将上述滤纸放入玻璃培养皿中，倒入溶剂浸泡，然后用毛笔轻轻将卵从滤纸上刷下，将培养皿倾斜，使卵集中于一侧，吸去多余溶剂，留下少许溶剂保持卵的湿润又不会使卵随意流动，置显微镜下观察计数(即洗脱计数)。每组重复3次，计算卵的洗脱率。

1.2.1.3 实验数据处理 卵的洗脱率=∑卵量(洗脱计数)/∑卵量(直接计数)

当卵量(洗脱计数)>卵量(直接计数)时，按后者计。

1.2.2 方法学考察

1.2.2.1 准确度实验 根据卵粒分布情况分为聚集组和离散组，离散组又根据卵量多少分为高卵量组、中卵量组、低卵量组，卵量分别为50～100、20～50、0～20粒，每组3个重复。按照1.2.1.2所确定的方法进行操作，将卵量(直接计数)视为真实值，计算准确率。

1.2.2.2精密度实验 按照1.2.2.1进行分组和操作，每个实验重复计数6次，计算RSD%(n=6)。

1.2.2.3重复性实验 按照1.2.2.1进行分组和操作，每个实验由3个人分别计数，计算RSD%(n=3)。

2 结果与分析

2.1 溶剂及浸泡时间的选择

实验结果表明，溶剂是对卵洗脱率的主要影响因素，其中70%乙醇对卵有较好的洗脱率。在该浓度下，不同浸泡时间对卵均有较高的洗脱率，考虑到节约时间并确保卵的洗脱，确定70%乙醇浸泡卵30 min为最佳实验条件(表1)。

表1 溶剂及浸泡时间对卵洗脱率的影响

2.2 方法学考察

2.2.1 准确度实验 直接计数与洗脱计数所测卵量见图1，实验结果以常规直接计数法所测卵量为标准。用洗脱计数法测定离散型分布的卵粒平均准确率为98.1%，此类型卵量的多少对准确率的影响不大。聚集型分布的卵粒所测结果的准确率受聚集卵粒的多少及密集程度的影响，如聚2、聚3为聚集在一起的卵粒不多的情况，所测结果与直接计数法十分接近；而聚1为聚集的卵粒多且整齐地排列成两层，所测结果与直接计数法相差较大，但此结果并不能说明洗脱计数法不准确，在此情况下，直接计数法所测卵量并不是真实值，因为上层可以计数而下层看不见，就只能根据经验估计；而在洗脱计数法中，70%乙醇溶液浸泡可使卵发生蛋白质变性，卵变得有弹性而不易破碎，可在显微镜下用解剖针将聚集在一起的卵分开，并可拨动以观察各个面，计数更为准确。所以采用将卵在70%乙醇中浸泡30 min后，再将卵洗脱下来计数，结果准确度高。

图1 直接计数法与洗脱计数法所测卵量对比

2.2.2 精密度实验 实验结果表明，洗脱计数法的精密度高，而常规直接计数法在卵粒多而密集的情况下精密度较差(表2)。

表2 精密度实验结果(RSD%，n=6)

2.2.3 重复性实验 实验结果表明，洗脱计数法有较好重复性，而常规直接计数法在卵粒多而密集的情况下的重复性较差(表3)。

表3 重复性实验结果(RSD%，n=3)

3 讨论

本方法准确性高、精密度及重复性好、操作简便，可用于马铃薯块茎蛾卵粒的计数。本方法的关键环节在于卵粒的洗脱，70%乙醇浸泡30 min可使卵粒有较高的洗脱率。只要能将卵粒都洗脱下来，置显微镜下计数就很容易了，一方面由于卵的蛋白质变性，卵由半透明变成白色，方便观察；另一方面，卵集中在一起，1～2个视野下就可数完。

本实验采用的是产在滤纸上的卵，而实验中马铃薯块茎蛾的卵还可能产在马铃薯、烧杯等容器壁上，都可以使用本方法进行卵粒的计数。烧杯等容器可装满70%乙醇浸泡，由于杯壁比滤纸更光滑，卵粒易被洗脱，且卵粒较重，沉于容器底部，可用吸管将其吸取转移到培养皿中；马铃薯上的卵由于多分布于芽眼、破皮下或裂缝中，难以用毛笔刷下，可将未刷下的卵粒连同少量马铃薯块茎切下，在显微镜下，用解剖针将卵粒慢慢剥离出，耗时会较长，但准确性高，此外，实验时挑选光滑、无起皮、无伤口的马铃薯，可大大降低马铃薯上卵粒计数的难度。

[1] 丁锦华,洪晓月.农业昆虫学(第二版)[M].北京:中国农业出版社,2007:144-146.

[2] 农业部外业入侵生物预防与控制研究中心.中国主要农林入侵物种与控制(第1辑)[M].北京:中国农业出版社,2004:27-29.

[3] Devi M B D A. Biology of potato tuber mothPhthorimaeaopercullela(Zeller)[J]. Ann. Pl. Protec. Sci., 2015, 21(2): 276-278.

[4] 金凤,嵇保中,刘曙雯,等.昆虫产卵分泌物的产生方式、成分及功能[J].昆虫学报,2009,52(9):1008-1016.

[5] 朱保健,刘朝良,董胜张,等.家蚕蛾粘液腺及其分泌物的初步研究[J].蚕业科学,2003,29(4):436-438.

(责任编辑：曾小军)

A New Method for Counting of Eggs of Potato Tuber Moth

WU Mei1,2, LIU Yan1, LI Ting-xi2, DUAN Ping2, XIAO Chun1*

(1. College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;2. College of Pharmaceutical Science, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China)

In order to overcome the shortcomings of the conventional method for the counting of eggs of potato tuber moth, such as large workload, inaccurate counting results due to the high gathering of eggs, this research established a new method for the counting of eggs of potato tuber moth: soaking eggs in 70% ethanol solution for half an hour, then brushing the eggs down gently by brush pen, finally counting them under a microscope. The methodological survey proves that this method is accurate, precise, repeatable and simple, and it can be applied to count the eggs of potato tuber moth.

Potato tuber moth; Egg; Counting method

2017-02-22

国家自然科学基金(31560607)。

吴梅(1975─)，女，云南昆明人，博士研究生，从事昆虫化学生态方面研究。*通讯作者：肖春。

S435.32

A

1001-8581(2017)06-0063-03