不同激素浓度配比对竹叶石斛种子快繁的影响

周年英，蒋双林，黄翠娥，王业鹏，肖 杰，李丽娜

(湖北省天门市绿色食品管理办公室，湖北 天门 431700)

不同激素浓度配比对竹叶石斛种子快繁的影响

周年英，蒋双林，黄翠娥，王业鹏，肖 杰，李丽娜

(湖北省天门市绿色食品管理办公室，湖北 天门 431700)

以竹叶石斛(DendrobiumhancockiiRolfe)的成熟种子为实验材料，以1/2MS为基本培养基，研究了不同浓度激素配比对竹叶石斛的原球茎增殖分化和生根壮苗培养的影响，以期建立竹叶石斛的种子快繁技术，结果表明：竹叶石斛成熟种子在1/2MS萌发培养基中，45 d即可出现大量原球茎，种子萌发率高达95%；在原球茎分化阶段，最佳培养基为1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，pH 5.8，50 d左右即可分化成小植株；在生根壮苗培养阶段，最佳生根培养基为1/2MS+NAA 0.7 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，pH 5.8，45 d左右组培苗长到3 cm以上，根的条数为2条以上，叶2片以上。利用组织培养技术进行竹叶石斛种子快速繁殖，以1/2MS为基本培养，从种子萌发到无菌苗生根并达到炼苗移栽要求所需的时间在150 d以内，这大大加快了竹叶石斛种子繁殖速度，为竹叶石斛的快速生产提供了便利。

竹叶石斛；种子快繁；激素浓度；生根培养

竹叶石斛又名细叶石斛(DendrobiumhancockiiRolfe)，兰科石斛属，多年生附生草本，是传统名贵中药材，具有生津养胃、润肺止咳、增强人体免疫力等功效，故有极高的药用价值和经济价值。此外，竹叶石斛的观赏价值极高，其花姿优雅、玲珑可爱、花色鲜艳、气味芳香，被喻为“四大观赏洋花”之一，既可作切花，也可盆栽观赏。竹叶石斛的种子非常细小，自然繁殖率极低，而传统的分株繁殖和扦插繁殖方法速度较慢，因此难以满足市场需求。野生竹叶石斛被滥采滥挖，自然资源稀缺。因此，为了高效利用和保护竹叶石斛，本实验利用组织培养技术对竹叶石斛进行快速繁殖，探讨了竹叶石斛种子无菌培养的方法和条件，旨在为工厂化生产提供技术依据。

采用植物组织培养技术是获得大量繁殖种苗的有效途径，目前研究利用较多、较为系统的是铁皮石斛，而关于竹叶石斛的组织培养技术却未见系统报道。铁皮石斛用于组培的外植体有种子[1]、茎段[2-4]、叶[5]、根[6-7]等。宋顺等[8]研究了在MS培养基中添加不同浓度的激素对铁皮石斛的诱导、增殖、分化以及生根的影响，并筛选出每个阶段的最佳培养基。但是在竹叶石斛组织培养方面未见相关报道。本文以竹叶石斛成熟种子为实验材料，以1/2MS为基本培养基，研究不同浓度激素配比对竹叶石斛的原球茎增殖分化和生根壮苗培养的影响，从而建立一条快速、高效的竹叶石斛种子快繁技术，为竹叶石斛工厂化生产提供技术和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

竹叶石斛未开裂的成熟果荚。培养基均含蔗糖30 g/L、琼脂粉7 g/L、pH值调至5.8，在121 ℃灭菌20 min。

1.2 实验方法

1.2.1 外植体消毒 在超净工作台中，先用75%酒精擦拭果荚表面，0.1%升汞处理10 min，无菌水冲洗3～5次，最后用无菌滤纸吸干果荚表面的水分，取出种子并均匀接种于萌发培养基中，撒上薄薄的一层即可。种子萌发培养基分别为MS和1/2MS。

培养条件为：25 ℃，2000 lx，12 h/d。

1.2.2 原球茎增殖、分化培养 取无菌的竹叶石斛的原球茎接种于添加了不同浓度的6-BA和NAA的1/2MS基本培养基中，具体组合1～7如下：(1)1/2MS；(2)1/2MS+6-BA 2.0 mg/L；(3)1/2MS+NAA 0.2 mg/L；(4)1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；(5)1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；(6)1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；(7)1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

培养条件为：25 ℃，2000 lx，12 h/d。观察不同浓度的6-BA和NAA对竹叶石斛分化培养的影响。

1.2.3 生根壮苗培养 将诱导分化获得的竹叶石斛无菌苗接种于以下生根壮苗培养基中诱导生根。生根壮苗培养基如下：(1)1/2MS；(2)1/2MS+NAA 0.1 mg/L；(3)1/2MS+NAA 0.5 mg/L；(4)1/2MS+NAA 0.7 mg/L。

培养条件为：25 ℃，2000 lx，12 h/d。观察实验过程中不同培养基中竹叶石斛的生根情况并记录实验结果。

1.2.4 炼苗移栽 待无菌苗长到3 cm以上，根数在2条以上，即可进行炼苗移栽。

1.2.5 数据分析 利用Excel 2003进行数据统计，利用SPSS 16.0软件进行数据邓肯氏新复极差显著性分析。

2 结果与分析

2.1 原球茎诱导

1/2MS萌发培养基中的竹叶石斛种子，大约第45 d从黄色转为绿色，出现1～3 mm的原球茎(图1)，并且种子的萌发率高达95%。而在MS萌发培养基中的萌发率为80%(图2)。

图1 萌发培养阶段

图2 不同培养基对竹叶石斛种子萌发率的影响

2.2 原球茎增殖与分化

待萌发培养基中的竹叶石斛出现1～3 mm的原球茎即可在无菌条件下转接到原球茎分化培养基中，原球茎的增殖与芽分化同时进行。由图3可知，7种培养基都能分化出小植株，其中1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基的分化效果最佳，平均芽数为4.24个，同时获得小植株的时间较其他培养基获得的时间短10 d左右，原球茎在培养50 d左右即可分化成小植株(图4)。

2.3 生根壮苗

将试管苗接种于生根壮苗培养基，结果见表1，发现添加一定浓度NAA培养基的生根率高于未添加NAA的培养基，分别添加0.5、0.7 mg/L NAA的1/2MS培养基的生根率与未添加NAA的培养基之间都存在显著性差异。并且发现1/2MS+NAA 0.7 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，pH 5.8～6.0培养基的效果最佳，生根率达到100%，大约25 d小苗的茎节上开始出现根的分化，50 d左右组培苗长到3 cm以上，根的条数为2条以上，根系粗壮，植株叶色浓绿、生长健壮(图5)。

图3 不同浓度激素及配比对竹叶石斛的分化能力的影响

图4 分化培养阶段

图5 生根培养阶段

基本培养基NAA浓度/(mg/L)接种苗数生根数生根率/%1/2MS0958690.53b0.1918694.51ab0.5929097.83a0.79797100.00a

注:同列不同小写字母表示差异显著达显著水平(P<0.05)。

2.4 炼苗移栽

当竹叶石斛无菌苗长到3 cm以上，根数大于2～3条，根系长于2 cm时，基本上是在试管苗转入生根培养基大约50 d的时候即可进行室内炼苗(图6)。具体操作如下：首先让无菌苗在自然光条件下炼苗7 d，然后先半打开封口膜1 d，再完全开瓶炼苗2 d后，再开始进行移栽。移栽前，用镊子先将苗轻轻取出，尽量不要伤到根系，用清水洗净无菌苗根部残留的培养基，再用0.1 mg/L NAA的水溶液进行蘸根3～5 min，然后移栽至装有基质(草炭∶木屑=1∶2)的营养钵中，浇透水后罩上塑料膜进行保温保湿。7 d后撤去塑料膜，并逐渐加大通风、增强光照。注意通风和温湿度的控制，湿度控制在70%～85%，温度为20～28 ℃。1个月后成活率高达90%(图7)。

3 讨论

现已发现通过组织培养技术快速获得石斛再生植株的途径有2种：一是以成熟的种子为外植体进行组织培养获得完整植株；二是通过茎段、茎尖、叶片等诱导形成丛生芽或拟原球茎来实现快繁[9]。影响石斛组织培养的因素主要有培养基类型、pH、激素配比和添加物、培养温度等[10-11]。铁皮石斛原球茎增殖分化可以以1/2MS、MS等作为基本培养基[12-13]。蒋波等对铁皮石斛原球茎生长分化及生根壮苗的研究表明：培养基中不同浓度激素配比是影响原球茎增殖和分化的关键因素，原球茎的增殖以1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L或1/2MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L这2种培养基为佳，其原球茎的增殖系数较大；原球茎的分化以1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L或1/2MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L为佳[14]。而郑志仁等研究表明，铁皮石斛原球茎增殖与分化的适宜培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+10%土豆汁[15]。王一诺等研究了不同浓度激素配比对重唇石斛组织培养的影响，结果表明：重唇石斛的最佳启动培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，最佳继代增殖的培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+KT 0.2 mg/L+AC 1.0 mg/L，最优生根壮苗培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+AC 1.0 mg/L，生根率达到90%以上[16]。

图6 炼苗移栽

图7 移栽成活

本实验利用组织培养技术进行竹叶石斛种子的快速繁殖，在1/2MS种子萌发培养基中，45 d即可出现大量原球茎，种子萌发率高达95%。在原球茎分化阶段，50 d左右即可分化成小植株，最佳培养基为1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，pH 5.8，这与莫昭展等[17]的研究结果不同。原球茎增殖与分化是同步进行的，这与王丽萍等[18]研究结果一致。在生根壮苗培养阶段，最佳生根培养基为1/2MS+NAA 0.7 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，pH 5.8～6.0，45 d左右组培苗长到3 cm以上，根的条数为2条以上，叶2片以上。

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(责任编辑：曾小军)

Effects of Different Concentrations of Hormone Combinations on Seed Rapid Propagation ofDendrobiumhancockii

ZHOU Nian-ying, JIANG Shuang-lin, HUANG Cui-e, WANG Ye-peng, XIAO Jie, LI Li-na

(Green Food Management Office of Tianmen City, Hubei Province, Tianmen 431700, China)

Using the mature seeds ofDendrobiumhancockiiRolfe as experimental materials, taking 1/2MS as basic culture medium, we studied the effects of different concentrations of hormone combinations on the differentiation, propagation and rooting ofD.hancockiiprotocorms, in order to establish a rapid seed propagation technique system. The results showed that it just needed 45 days to appear a large number of protocorms when the mature seeds ofD.hancockiigerminated in 1/2MS medium, and the rate of seed germination reached 95%. In protocorm differentiation phase, the best medium was 1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ sucrose 30 g/L+ agar 7 g/L (pH 5.8), and it needed only about 50 days for protocorm to differentiate into plantlets. The best rooting medium was 1/2MS+NAA 0.7 mg/L+ sucrose 30 g/L+ agar 7 g/L (pH 5.8); after rooting culture for 45 days or so, the plantlets grew to 3 cm, the number of roots exceeded 2, and the number of leaves was more than 2. When the seeds ofD.hancockiiwere propagated under the above optimum culture medium conditions, the duration from germination of seeds to formation of healthy and strong plantlets was within 150 days, which could provide convenience for the rapid production ofD.hancockii.

Dendrobiumhancockii; Seed rapid propagation; Concentration of hormone; Rooting culture

2017-02-09

湖北省省级现代农业项目(鄂财农发[2015]44号)。

周年英(1990─)，女，农艺师，从事组织培养、“三品一标”认证开发与推广以及蔬菜生产管理。

S682.31

A

1001-8581(2017)06-0044-05