和田黑鸡与普通商品鸡体液免疫水平差异分析

王娟娟，孔维欢，吴书奇，李莲瑞*

（1.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000；3.塔里木大学动物科技学院，新疆阿拉尔843300）

和田黑鸡与普通商品鸡体液免疫水平差异分析

王娟娟1,2，孔维欢2，吴书奇3，李莲瑞3*

（1.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000；3.塔里木大学动物科技学院，新疆阿拉尔843300）

利用硫酸铵盐析法提取免疫球蛋白，采用SDS聚丙烯酰胺法和玫瑰花环试验的结果判定和田黑鸡（未注射疫苗）和普通商品鸡（注射疫苗）体液免疫水平的差异，并分析疫苗对于家禽免疫力的影响。因和田地区大部分的和田黑鸡都不予以注射疫苗，导致和田黑鸡的免疫力和抗病力都较低，极大影响了和田黑鸡的商品效益和品种的品质，而普通肉用商品鸡因出生就开始免疫，免疫力和抵抗力都优于和田黑鸡，所以本试验分别提取未注射疫苗的和田黑鸡和普通商品鸡的外周血，通过密度梯度离心法分离血清，采用盐析法提取血清中的免疫球蛋白IgG，然后将提取的IgG进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，对比相同浓度下，和田黑鸡和普通商品鸡IgG的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳轻链和重链的蛋白量，同时，进行和田黑鸡和普通商品鸡EAC花环对比试验，分析疫苗注射对免疫力影响的高低。通过试验可以看出普通商品鸡IgG的轻链和重链的蛋白量都显著大于和田黑鸡，并且经统计普通商品鸡的EAC花环率为23.42%，和田黑鸡的EAC的花环率为15.3%，运用统计学对两个样本进行差异显著性检验分析，可以看出普通商品鸡的EAC花环率比和田黑鸡的EAC花环率差异显著(0.01＜P≤0.05)，试验结果显示疫苗注射后的普通商品鸡体液免疫水平要远远高于和田黑鸡，疫苗注射能够刺激普通商品鸡机体主动产生特异性免疫应答增强免疫力，预防疾病，这为和田黑鸡疫苗注射的推广和后期的疫苗研发提供了必要的参考依据，通过选择合适的疫苗并进行免疫，是保证家禽养殖的成功和工作人员人身安全的重要手段。

和田黑鸡和普通商品鸡；体液免疫；差异分析；

IgG（免疫球蛋白）是一类具有抗体活性或化学结构与抗体相似的免疫球蛋白，普遍存在于哺乳动物的血液、组织液及外分泌液中，在动物体内具有重要的免疫和生理调节作用，是动物体内免疫最关键的组成物质之一，根据化学结构和抗原性差异，免疫球蛋白可分为IgG、IgM、IgA、IgE和IgD[1]，鸡的lgG主要存在IgM、IgA和IgG中，其中IgG又称作IgY，相当于哺乳动物的lgG和IgE[2]，IgG主要是从血清和卵黄中提取，而卵黄抗体是由血清抗体(主要是IgG)在卵黄中的积累形成的[3]，IgG是介导体液免疫的主要抗体，单体分子结构都是相似的，为两条相同的重链和轻链四条肽链构成的“Y”字形的分子，重链包括可变区（variable region,VH）和恒定区（constant region,CH），轻链可变区（VL）与重链的可变区相对应，构成抗体分子的恒定区（CL）[4]，红细胞受体(ER)能与动物的红细胞结合形成玫瑰花结[5]，通过玫瑰花环抑制试验[6,7]可以反应出和田黑鸡和普通商品鸡的免疫力的高低，这对动物疫病诊治、饲养繁殖以及血液学特性的深入研究等方面都提供了重要参考依据[8]，也为和田黑鸡的品种资源保种和扩繁提供基础的参考材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物普通商品鸡（图1）与和田黑鸡（图2）来源：塔里木大学动科院实验站（注：和田黑鸡未注射疫苗，商品鸡已注射疫苗）；豚鼠：养殖场购买。

图1 普通商品鸡

图2 和田黑鸡

1.1.2 试验试剂磷酸盐缓冲液、50%硫酸铵溶液、pH8.0的0.005mol/L磷酸缓冲液、奈氏试剂1mmol/L EDTA、30%丙稀酰胺、Tris(pH8.8)、Tris (pH6.8)、10%SDS、10%过硫酸铵、DTT、TEMED、鸡红细胞悬液、补体。

1.1.3 试验主要仪器雪花制冰机（FM180型北京长流科技仪器公司）；电热恒温水浴锅（OK-S26型上海精宏实验设备有限公司）；高速台式冷冻离心机（Neofuge15R型力康发展有限公司）；垂直板状电泳仪（DYC2-24DIV型北京六一仪器制造厂）；电脑三恒多用电泳仪（DYY―10C型北京六一仪器制造厂）；低速台式离心机（TDL-5上海安亭科学仪器厂）；70℃超低温冰柜(DN-HW328中科美菱低温科技有限责任公司)；电子天平(BS124S北京市赛多利斯仪器系统有限公司)；超净工作台（SW-CJ-2F型上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；全自动摄影生物显微镜（DP70+B10-olysLIA日本奥林巴斯）；电子万用炉（DL-1型北京永光明医疗仪器厂）；紫外可见分光光度计（Golds54型上海棱光技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 IgG的分离和纯化[11]及蛋白电泳IgG的分离纯化：取抗血清2ml加2ml PBS(血清已用Hanks液稀释一倍），慢慢摇动避免形成泡沫。在冰浴中逐滴加入4ml饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，以防止形成团块，减少沉淀。此时即有大量的γ-球蛋白沉淀（主要是IgG）[9]，置4℃冰箱静置30 min冷冻离心(3000rpm，15min)，弃上清。沉淀用2ml PBS缓冲液溶解。逐滴加入1ml饱和硫酸铵边加边搅拌，使饱和度为33%，置4℃冰箱30 min，离心收集沉淀（3000rpm，15min），反复三次，可得到较纯的IgG。

1.2.2 IgG的浓度测定提前将仪器打开，待仪器开机与自校成功后，预热30min后进行测定工作，调波长，放置标准液，调吸光度，将普通商品鸡和和田黑鸡的原倍IgG样品加入比色皿中，放入仪器的样品室内，记住放置的顺序。盖下样品室盖。依次向外拉出相应“1”、“2”位置，读出相应的吸光度值。通过读数对比普通商品鸡和和田黑鸡的IgG的样品浓度是否一致，如有差异再进行调整使两者浓度相等。经测定普通商品鸡和和田黑鸡的OD280值为1.78[10]。

1.2.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制[5]及电泳按蛋白电泳槽厂商使用指南安装玻璃平板夹层并固定，确定所需凝胶溶液体积，按表1的数值配制相应浓度的分离胶溶液，并按顺序加样。取蛋白浓度一致的普通商品鸡与和田黑鸡血清IgG样品10μl，用PBS倍比稀释至8倍后，加等体积的1×SDS凝胶加样缓冲液，5min沸水浴后离心。

将电泳装置与电源相接（正极应接下槽），凝胶上所加电压为8v/cm。当染液前沿进入分离胶后，把电压提高到15v/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部（约需4h）。

表1 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液

按表2制备积层胶：按表给出的数据在离心管中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，依次混合各成分。加入TEMED后，立即混匀液体并进入下一步操作,配制积层胶所需溶液。

表2 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所用溶液

1.2.4 染色与脱色在45ml甲醇和45ml水（1: 1）和10ml冰乙酸的混合液溶解0.25g考马斯亮蓝R250，用滤纸过滤染液去除颗粒状物质，要用染液完全浸泡凝胶，放在平缓摇动的平台上于室温染色4h以上，移出并回收染液以备后用，将凝胶浸泡于不加染料的脱色液中，平缓摇动4～8h，其间应更换脱色液三四次。脱色越充分，考马斯亮蓝染色法的蛋白质检出下限就越低，脱色24h通常能检测到单一条带中含量低至0.1μg的蛋白质，脱色后，可将凝胶浸于水中，用于后续拍照，脱色时要注意控制脱色时间，过长的脱色时间或者过短的脱色时间对结果都会产生影响。

1.2.5 EAC花环形成试验[11]EAC悬液的配制：取4%的CRBC悬液（鸡红细胞悬液）200μl加等量的用无钙、镁Harks液稀释成一定浓度的溶血素混匀，置37℃水浴15min，取出后加入50μl（原倍、10倍、50倍、100倍）稀释的补体，再放于37℃水浴15min取出，备用。

淋巴细胞的分离：取加1ml无钙、镁的Harks液的抗凝血1ml沿管壁轻轻地加入装入1ml分层液的小试管中，使二者保持清晰的界面，置低速台式离心机中2000rpm离心20min，取出后吸出富含淋巴细胞层，备用。

取50μl淋巴细胞悬液加50μl EAC悬液混匀，室温放置30min后，1000rpm离心5min，弃上清，留少许液体，将试管慢慢旋转使细胞悬起，最后再取一滴细胞悬液于载玻片上，慢慢涂开风干后进行染色。用100%乙醇滴1～2滴在载玻片上的细胞悬液上，1～2min后。用瑞氏染液染色4min。倾斜冲洗再用工作缓冲液染色4min。倾斜冲洗净染液后再用吉姆萨工作染液4min后冲洗净晾干后镜检。在高倍镜下计数200个淋巴细胞中形成EAC花环的百分数，淋巴细胞周围粘附3个以上CRBC者为EAC花环形成细胞。观察时要注意混入的多形核白细胞和单核细胞形成的花环，不应将其计入，可从形态上加以区分。

2 试验结果

2.1 淋巴细胞分离结果低速台式离心机中2000rpm离心20min后，可见清晰的分层，一般分为四层，分别为血浆层、淋巴细胞层、分离液层和红细胞层。从图3、图4我们可以明显的看出，未注射疫苗的和田黑鸡分离出的淋巴细胞的量要明显少于注射疫苗的普通商品鸡，在机体体液免疫和细胞免疫等特异免疫反应中，淋巴细胞起着重要作用，淋巴回流使淋巴结能很快地接受侵入机体的抗原刺激，经过一系列复杂的细胞和体液因子的作用，发动了对此抗原特异性的免疫反应，通过输出效应淋巴细胞或免疫活性成分，发动身体其他部位，特别是有害成分侵入区域的免疫反应，及时解除对机体的伤害，未进行疫苗免疫的和田黑鸡的淋巴细胞的数量明显少于疫苗注射的普通商品鸡，反映出了疫苗注射对于提高禽类的免疫能力具有重要的作用。

图3 和田黑鸡淋巴细胞分离图

图4 普通商品鸡淋巴细胞分离图

2.2 EAC花环试验的结果见图5、图6。

图5 和田黑鸡EAC花环

图6 普通商品鸡EAC花环

经统计和田黑鸡的EAC花环率为15.3%，普通商品鸡的EAC花环率为23.42%（健康动物的EAC花环率正常值为15%～30%），通过两个样本百分数差异显著性检验的统计学分析表明，普通商品鸡的EAC花环率与和田黑鸡的EAC花环率差异显著(0.01〈P≤0.05)[12]。说明普通商品鸡的B淋巴细胞数目比和田黑鸡多。花环统计结果见表3。

表3 和田黑鸡与普通商品鸡EAC花环统计结果

2.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶的电泳结果见图7、图8。

IgG是血清主要的抗体成分，约占血液中IG总量的70%～75%，在结合补体、增强免疫细胞、吞噬病原微生物和中和细菌毒素的能力方面具有重要作用，能有效地抗感染。重链又称H链，大约由420～440个氨基酸组成，分子量约为50000～77000。轻链又称L链，由213～214个氨基酸组成，分子量约为22500。从图7、图8看出，普通商品鸡和和田黑鸡跑出两条清晰的条带。一条带在67～70KD之间，另一条带在25～29.0KD之间[13]，正好符合IgG的重链带和轻链带的分子量，IgG是动物血清中含量最高的免疫球蛋白，占血清免疫球蛋白含量的75%～80%，IgG也是介导体液免疫的主要抗体，尤其是在机体的免疫反应中，IgG的含量最高，是体液免疫的主力军[14]。

图7 普通商品鸡IgG电泳(10mL血浆分离纯化)

图7中原倍代表1倍稀释，即为PBS和分离纯化血浆以1:1比例进行稀释，以此类推，是将上一次稀释后的血浆再按1:1比例进行再次稀释，× 4、×8、×16分别代表4倍稀释、8倍稀释和16倍稀释，通过SDS聚丙烯凝胶电泳，我们可以从图7上看到清晰的两条带，分别为重链和轻链，重链的分子量大小为67～70KD，而轻链的分子量大小为26～28KD,由于普通商品鸡的IgG含量较大，浓度较高，所以重链与轻链的条带较宽且颜色较深，这说明普通商品鸡具有较高的免疫力。

图8 和田黑鸡IgG电泳结果(10ml血浆分离纯化)

从图8得知，与普通商品鸡一样，和田黑鸡IgG电泳结果同样都具有重链和轻链，但其带宽要远远小于普通商品鸡的，且颜色较暗。通过图7、图8对比，可以看出普通商品鸡IgG的含量要远大于和田黑鸡，这反映出了普通商品鸡具有更强的免疫力。

5ml普通商品鸡血浆分离纯化得到的IgG凝胶电泳所得的结果见图9。

图9 普通商品鸡与和田黑鸡的IgG电泳（5ml）

从图9可以看出普通商品鸡的IgG含量依然很高，但和田黑鸡的IgG含量较低，轻链基本看不到条带，说明随着稀释度的递增两种鸡IgG含量都递减,并且普通商品鸡IgG的浓度要比和田黑鸡大，经实验摸索15ml和田黑鸡分离纯化后的血浆中IgG含量与5ml普通商品鸡分离纯化的血浆中IgG的含量相当，电泳结果见图10。

图10 普通商品鸡（5ml）和田黑鸡IgG电泳（15ml）

从图10可以看出，3倍的和田黑鸡血浆所提取的IgG含量与普通商品鸡的IgG含量大致相当，说明，普通商品鸡比和田黑鸡有更强的免疫能力，这反映出了疫苗注射对于商品鸡的免疫能力起到了很大的提高作用。

3 讨论

从未注射疫苗的和田黑鸡与注射疫苗的普通商品鸡在淋巴细胞分离、玫瑰花环及IgG聚丙烯凝胶电泳的结果都显示了疫苗免疫后的普通商品鸡比和田黑鸡具有更强的免疫力[15,16,17]，疫苗注射对于提高家禽的免疫力具有显著的作用。

Barrington[18]认为，对新生幼畜而言，成功的被动免疫就是适量、及时地摄取和吸收IgG，而中国医学科学院实验动物研究所的刘先菊、杨帆等人就专门研究了虎血清免疫球蛋白的纯化及活性鉴定的研究，并建立了一种简单快速的分离纯化虎血清的方位，为虎血清的IgG二级抗体的制备提供了高纯度、活性好的抗体疫原[19]。有学者发现猪瘟病毒(HCV)与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)同为黄病毒科、瘟病毒属成员，两者在基因结构和抗原性上有很高的同源性，具有共同的可溶性抗原，因此，可以产生交叉免疫保护作用，冯彦军等[20]、刘亚刚等[21]长期、多次的实验证明了用猪瘟弱毒苗预防牛病毒性腹泻黏膜病是安全有效的，所以，选择猪瘟弱毒苗来免疫犊奶牛具有显著效果，这都给我们在以后的饲养家禽过程中通过合理的饲喂管理和通过免疫注射的方法提高家禽的免疫力提供了重要的参考依据。国外的许多学者证明了免疫增强物质对提高动物体免疫力的重要性，在以后的研究过程中，要加强疫苗与免疫增强剂的研究，以促进我国家禽养殖产业的持续健康稳定的发展，在满足人们对健康饮食的要求的同时，实现家禽市场的可持续发展和经济效益的最大化。

[1]Isolauri E,Rautava S,Kalliomaki M.Food allergy in irritable bowel syndrome:new facts and old fallacies[J].Gut,2004,53(10):1391-1393.

[2]王永山.抗鸡IgG单克隆抗体的研究[J].兽医大学学报,1989,9(2):109～113.

[3]杨宗照,华荣虹,张书霞,等.鸭IgG的提取方法的比较试验[J],中国兽医科技,2001,31(4)：26-27.

[4]Millichap JG,Yee MM.The diet factor in pediatric and adolescent migraine[J].Pediatr Neurol,2003,28 (1):9-15.

[5]赵明,孙文东,努尔·波拉提,等.孕血清中早孕因子的分离纯化[J].畜牧兽医学报,2001,32(2):129-133.

[6]刘晓宇,孙文东,袁武梅,杨梅,等.孕妇血清中早孕因子的分离与纯化[J].新疆医科大学学报,2005,28(4): 315-317.

[7]徐贵卿.利用玫瑰花环试验对鸡外周血液T,B淋巴细胞的检测[J].畜牧与兽医,1984，4:160～162.

[8]舒文祥.鸡血清IgG纯化方法研究[J].安徽农业科学,2007,35(25):7835～7837.

[9]王廷华.蛋白质理论与技术[M].北京:科学出版社, 2005,3:96～107.

[10]Jain RI,F Fais,S Kaplan S,et a1.Ig H and L chain variable region gene sequence analyses of twelve synovial tissue derived B cell lines producing IgA,IgG,and IgM rheumatoid factors structure/function comparisons of antigenic specificity,V gene sequence,and Ig isotype[J]. Autoimmunity,1995,22(4):229～243.

[11]明道绪.生物统计附试验设计[M].第三版.北京:中国农业出版社,2002,6:84～87.

[12]王永山.抗鸡IgG单克隆抗体的研究[J].兽医大学学报,1989,9(2):109～113.

[13]顾有为,刘艳慧,陈会良,等.免疫球蛋白分离提取方法及其应用的研究进展[J].畜牧兽医科技信息, 2004，12:12-14.

[14]梅承君，康相涛，孙桂荣．对固始鸡与安卡鸡F2资源群体血液生化指标的研究[J]．江西农业大学学报，2007，29(2):257-261

[15]Rajpal S Kashyap,Shweta H Morey,et al,Detection of viral antigen,IgM and IgG antibodies in cerebrospinal fluid of chikungunya patients neurological complications[J].Kashyap,et al. Cerebrospinal Research,2012,12(7):1-6.

[16]McConnell,Michelle A,et al.A comparison of IgG and IgG activity in an early milk concentrate from non immunized cows and a milk from hyperimmunised animals[J].Food Research International,2001,34:255-261.

[17]Alexander I,Taylor,Gould,Brian J.Sutton,and Rosaleen,et a1.Avian IgY binds to a monocyte receptor with IgG like Kinetic Despite an IgE-like Structre[J].Joural of biological chemistry, 2008,283(24):16384-16390.

[18]Barrington G M,Parish S M,Garry F B. Immunodeficiency in south American camels[J]. Journal of Camel Practice and Research,1999,6 (2):185-190.

[19]刘先菊,杨帆,林树柱,等.虎血清免疫球蛋白(IgG)的纯化及纯度、活性鉴定[J].中国比较医学杂志, 2007,17(11)：637-640.

[20]冯彦君.猪瘟兔化弱毒对牛病毒性腹泻-黏膜病的防治作用[J].中国奶牛,1995,1:39-40.

[21]刘亚刚,殷中琼,刘世贵,等.猪瘟弱毒苗预防牛病毒性腹泻/粘膜病的短期安全性与微量中和试验[J].四川大学学报,2003,40(5):30-32.

S858.312.4

B

1673-1085（2017）06-0008-07和田黑鸡（尼雅型）是民丰县一种古老、珍贵和独特的地方家禽品种，也是新疆高寒地区农牧民养殖的主体家禽，肉质极佳，鲜嫩可口，随着其市场价值的递增，对和田黑鸡所进行的研究也越来越多，具有抗逆抗病性强、耐粗饲、抗高温、遗传性稳定、饲料报酬高、经济利用价值高的特点，且一年四季均有就巢性，并未与其他鸡种杂交，具有原始生态条件和品种的特殊性能，具有较高的绿色价值，是非常珍贵的保健食品之一，并且是优良的肉蛋兼用型地方品种,但和田地区大部分的养殖户因其实用价值，都未对其进行疫苗注射，并且极为反对对和田黑鸡进行疫苗免疫，这就造成了和田黑鸡普遍免疫力低下、抗病力差、死亡率高的现象，极大地影响了和田黑鸡的商品价值及市场经济效益，对和田黑鸡的大规模和持续性养殖也产生了极大的阻碍作用。目前关于和田黑鸡的研究资料甚少，尤其是关于疫苗免疫对于和田黑鸡免疫力影响研究的文章甚少，本文旨在通过对未注射疫苗的和田黑鸡和注射疫苗的商品鸡的免疫效果进行对照，为和田黑鸡疫苗免疫的推广提供切实可靠的参考依据。

2017-05-06

王娟娟（1986-），女，汉族，新疆吐鲁番人，现学在读博士，专业：动物遗传育种与繁殖，邮箱：wangjuanjuand10@163.com。

*通讯作者：李莲瑞（1968-），女，汉族，教授，博士，新疆库尔勒人,研究方向：动物基因工程，电子邮箱：lilianrui51@163.com。