视网膜母细胞瘤肿瘤标志物筛选研究

刘智屏，李 博，陈俐丽，张朝霞，陈言钊，唐芳政

·论著·

视网膜母细胞瘤肿瘤标志物筛选研究

刘智屏*，李 博，陈俐丽，张朝霞，陈言钊，唐芳政

背景 视网膜母细胞瘤(RB)多发于婴幼儿，就诊时多处于中晚期，治疗较困难，易复发转移。目的 筛选出对RB有临床意义的肿瘤标志物。方法 选取2014年8月—2016年8月在深圳市人民医院化疗且临床资料完整的RB患儿20例为RB组，同期选取本院体检健康的儿童20例为对照组。检测对照组体检时，RB组化疗前、化疗3个疗程后、化疗6个疗程后甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、糖蛋白抗原(CA)125、CA153、CA199、CA724水平。结果 对照组与RB组化疗前、化疗3个疗程后、化疗6个疗程后AFP、CEA、CA125、CA724水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；对照组与RB组化疗6个疗程后NSE水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；RB组化疗前、化疗3个疗程后NSE水平高于对照组(P<0.05)；RB组化疗前、化疗3个疗程后、化疗6个疗程后CA153、CA199水平高于对照组(P<0.05)。RB组化疗前、化疗3个疗程后、化疗6个疗程后AFP、CEA、CA125、CA153、CA199、CA724水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；RB组化疗6个疗程后NSE水平低于化疗前、化疗3个疗程后(P<0.05)。结论 血清NSE、CA153、CA199水平对RB诊疗有重要意义，可以作为RB的肿瘤标志物；其中NSE水平下降相对较早，更有利于早期诊断RB的复发。

视网膜母细胞瘤；肿瘤标记,生物学；甲胎蛋白类；癌胚抗原；神经元特异性烯醇酶；糖蛋白抗原

刘智屏,李博,陈俐丽,等.视网膜母细胞瘤肿瘤标志物筛选研究[J].中国全科医学，2017，20(18)：2213-2217.[www.chinagp.net]

LIU Z P,LI B,CHEN L L,et al.Identification of tumor biomarkers for retinoblastoma[J].Chinese General Practice，2017，20(18)：2213-2217.

视网膜母细胞瘤(RB)是婴幼儿眼部最常见的一种恶性肿瘤，在婴幼儿中的发病率约为1/20 000[1]。RB多发于2岁以下的婴幼儿，不易被早期诊断发现，就诊患儿多处于中晚期，使其治疗难度增加，治疗后容易出现转移复发。因此，早期诊断、通过监测化疗效果实现个体化治疗、早期发现复发及转移，对于降低RB病死率尤为重要。本研究通过动态检测RB患儿化疗前后甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、糖蛋白抗原(CA)125、CA153、CA199、CA724水平，筛选出对RB有临床意义的肿瘤标志物，以便更好地监测病情发展，评价治疗效果，早期发现转移复发情况，制定适宜的化疗方案。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年8月—2016年8月在深圳市人民医院化疗且临床资料完整的RB患儿20例为RB组。其中男8例，女12例；月龄3～57个月，平均月龄(19.8±16.2)个月；单眼14例，双眼6例；行眼球摘除术治疗者9例；疾病分期：眼内期14例(A～C期4例，D期7例，E期3例)，青光眼期2例，眼外期4例。纳入标准：根据眼眶CT、双眼彩色超声多普勒、儿童眼底照相机检查结果或眼球摘除术后病理检查确诊为RB。排除标准：(1)同时合并其他系统疾病的患儿；(2)既往进行不规范治疗的患儿；(3)不能坚持完成化疗疗程的患儿。同期选取本院体检健康的儿童20例为对照组。其中男7例，女13例；月龄2～65个月，平均月龄(22.0±16.6)个月。纳入标准：年龄<10岁，无特殊既往史或家族史。排除标准：其他体检结果有异常者。两组性别、月龄比较，差异无统计学意义(χ2=0.107，P=0.744；t=0.427，P=0.672)。本研究经深圳市人民医院伦理委员会审批通过，研究对象家属均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 化疗方法 根据疾病分期制定治疗方案。所有患儿应用CEV化疗方案：3周为1个疗程。长春新碱1.5 mg/m2，静脉滴注1次/周，每个疗程共3次；依托泊苷150 mg/ m2，静脉滴注1次/d，连用3 d，每个疗程共3次；卡铂560 mg/m2，静脉滴注1次/d，每个疗程共1次。A～C期化疗6个疗程；D、E期化疗6～8个疗程，眼外期全身化疗延长至9～12个疗程。每个化疗疗程第1天鞘内注射甲氨蝶呤12.5 mg/m2，最大剂量12.5 mg；地塞米松2.5 mg(<3岁)或5 mg(≥3岁)。各患儿均定期于眼科医院随诊。

1.2.2 检测方法 对照组于体检时，RB组于化疗前、化疗3个疗程后、化疗6个疗程后，分别用干燥管采集其清晨空腹静脉血3 ml，室温下静置30 min，待自凝后4 000 r/min离心10 min(离心半径8 cm)，分离血清后置于-20 ℃冰箱保存待检。采用化学发光法(Roche公司Cobase 601全自动化学发光免疫分析仪)及原装配套试剂盒(Roche公司)测定AFP、CEA、NSE、CA125、CA153、CA199、CA724水平，按照厂家说明书严格操作。

1.2.3 判断标准 参照Roche公司提供的标准，各肿瘤标志物参考范围为：AFP<9.00 μg/L，CEA<10.00 μg/L，NSE<15.20 μg/L，CA125<35.00 kU/L，CA153<25.00 kU/L，CA199<39.00 kU/L，CA724<10.00 kU/L，大于参考范围为阳性结果。

2 结果

对照组与RB组化疗前、化疗3个疗程后、化疗6个疗程后AFP、CEA、CA125、CA724水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；对照组与RB组化疗6个疗程后NSE水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；RB组化疗前、化疗3个疗程后NSE水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；RB组化疗前、化疗3个疗程后、化疗6个疗程后CA153、CA199水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

RB组化疗前、化疗3个疗程后、化疗6个疗程后AFP、CEA、CA125、CA153、CA199、CA724水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；RB组化疗前、化疗3个疗程后、化疗6个疗程后NSE水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；RB组化疗6个疗程后NSE水平低于化疗前、化疗3个疗程后，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table1LevelsofAFP,CEA,NSE,CA125,CA153,CA199,andCA724inthecontrolgroup,andintheRBgroupmeasuredbeforechemotherapy,atthetimeofcompletingthethirdandsixthcyclesofchemotherapy

组别例数AFP(μg/L)化疗前 化疗3个疗程后 化疗6个疗程后F值P值CEA(μg/L)化疗前 化疗3个疗程后 化疗6个疗程后F值P值对照组2014.62±45.69a14.62±45.69a14.62±45.69a--2.42±1.24a2.42±1.24a2.42±1.24a--RB组2022.48±60.2818.42±48.0715.25±37.260.1080.8983.17±2.953.20±2.563.14±2.420.0020.998t值0.4650.2560.0481.0471.2161.186P值0.6450.7990.9620.3050.2340.246组别NSE(μg/L)化疗前 化疗3个疗程后 化疗6个疗程后F值P值CA125(kU/L)化疗前 化疗3个疗程后 化疗6个疗程后F值P值对照组29.31±10.14a29.31±10.14a29.31±10.14a--20.68±8.65a20.68±8.65a20.68±8.65a--RB组43.77±20.1038.50±15.0028.73±9.13bc4.9040.01118.79±5.6518.42±4.9718.76±5.130.0320.969t值2.8712.270-0.191-0.818-1.016-0.854P值0.0080.0290.8500.4190.3180.400组别CA153(kU/L)化疗前 化疗3个疗程后 化疗6个疗程后F值P值CA199(kU/L)化疗前 化疗3个疗程后 化疗6个疗程后F值P值对照组10.59±3.28a10.59±3.28a10.59±3.28a--19.83±13.37a19.83±13.37a19.83±13.37a--RB组18.63±11.0718.00±8.8914.35±6.561.3120.27740.62±28.0839.04±24.8032.29±20.350.6460.528t值3.1173.4992.2932.9913.0492.289P值0.0050.0020.0300.0060.0050.028组别 CA724(kU/L)化疗前 化疗3个疗程后 化疗6个疗程后F值P值对照组1.94±1.90a1.94±1.90a1.94±1.90a--RB组1.20±0.321.21±0.331.21±0.370.0120.988t值-1.726-1.692-1.647P值0.1000.1060.114

注：RB=视网膜母细胞瘤，AFP=甲胎蛋白，CEA=癌胚抗原，NSE=神经元特异性烯醇化酶，CA=糖蛋白抗原，-为无此项数据；a为对照组于体检时检测指标；与RB组化疗前比较，bP<0.05；与RB组化疗3个疗程后比较，cP<0.05

3 讨论

RB多发于2岁以内婴幼儿，就诊患儿多处于中晚期，使其治疗较为困难。目前RB的治疗采用CEV方案化疗结合局部治疗、眼球摘除术、外照射、基因治疗、中医治疗等[2]。尽管目前有统一的化疗方案并且综合治疗效果取得了不错的进展，但部分早期保眼患儿经过化疗后病情仍进展，需行眼球摘除术，部分行眼球摘除术的患儿化疗后仍出现眼外转移情况，也有部分患儿化疗结束后出现复发或远处转移[3]。目前多根据眼眶CT、双眼彩色超声多普勒、儿童眼底照相机检查、脑脊液细胞学检查及颅脑CT/MRI等检查判断疗效以及有无复发及转移[4]，但出现影像学改变后才发现相对较晚，因此希望能寻找对RB的疗效监测及预后判断更便捷、敏感的指标。

随着现代诊疗技术和分子生物学的迅猛发展，血清肿瘤标志物已广泛应用于各种肿瘤的早期诊断、疗效监测和预后评估。肿瘤标志物是在肿瘤细胞发展和增殖过程中，由肿瘤细胞本身合成、分泌或是机体对肿瘤细胞发生反应而产生的一类物质[5]。血清肿瘤标志物是一种易反复操作、安全、无创、简便快捷的检测手段。但关于RB肿瘤标志物的研究并不多，尚未发现RB特异性的肿瘤标志物。所以本研究选择了7个常用的、易检测的指标进行研究。

血清NSE是一种神经源性和神经内分泌细胞分泌的、特有的烯醇化酶的同工酶。研究显示，肺癌化疗后血清NSE水平显著下降，其可作为评价疗效、判断预后的重要指标[6]。国外已相继有文献报道将NSE检测用于RB的诊断[7]。有研究表明，RB化疗后血清NSE水平明显下降，血清NSE水平的测定对于RB远处转移有诊断价值[8]。本研究结果显示，RB组化疗前、化疗3个疗程后NSE水平高于对照组，化疗6个疗程后NSE水平与对照组无差异，RB组化疗6个疗程后NSE水平低于化疗前、化疗3个疗程后，与上述研究结果[8]相似，说明NSE可以作为RB的肿瘤标志物。关于RB患儿NSE水平异常机制目前尚无深入研究，可能与视神经元相关。

CA153最早发现于乳腺癌上皮细胞，血清CA153常在乳腺癌中过度表达，是监测浸润性乳腺癌或转移性乳腺癌的重要标志物，在其他一些恶性肿瘤如肺癌、胃癌、卵巢癌中其水平也有增高[9]。有研究表明，晚期乳腺癌患者一线化疗有效后，随诊中CA153等肿瘤标志物水平升高早于影像学的改变，早期给予二线治疗可改善预后[10]。本研究结果显示，RB组化疗前、化疗3个疗程后、化疗6个疗程后CA153水平高于对照组，推测CA153可以作为RB的肿瘤标志物；RB组化疗6个疗程后CA153水平低于化疗前、化疗3个疗程后，但无统计学差异，可能与本研究观察时间较短有关，需要进一步研究证实。CA153与RB的关系在国内外文献中鲜有报道，CA153水平在RB中升高的机制有待进一步研究。

CA199是一种黏蛋白型糖蛋白肿瘤标志物，在血清中含量甚微，常分布于正常胎儿的胰腺、胆囊、肝脏、肠和正常成年人的胰腺、胆管上皮等处，是迄今为止报道的对胰腺癌敏感性最高的肿瘤标志物，在一些消化道炎症中CA199水平也有不同程度升高[11]。有研究表明，血清CA199水平变化与结肠癌化疗效果相关，其对评估化疗效果有一定的价值[12]。CA199与RB的关系鲜有报道。本研究结果显示，RB组化疗前、化疗3个疗程后、化疗6个疗程后CA199水平高于对照组，推测CA199可以作为RB的肿瘤标志物；RB组化疗6个疗程后CA199水平低于化疗前、化疗3个疗程后，但无统计学差异，可能与本研究观察时间较短有关。但其水平升高的具体机制有待进一步研究。

AFP是目前公认的肝脏肿瘤最有特异性的肿瘤标志物，在一些消化道肿瘤及胚胎瘤中，AFP水平也有不同程度的升高[13]。CEA是一种糖蛋白，在成人血清中含量极少，在其他多器官恶性肿瘤如胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌等过度表达，属于非器官特异性肿瘤相关抗原，目前其主要作为结肠癌的一个预测指标[14]。CA125是一种高分子糖蛋白复合物，其水平升高主要见于妇科肿瘤或乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肠癌、肺癌以及一些炎性疾病，现已被应用于卵巢肿瘤的诊断、预后评估及随访[15]。CA724是一种黏蛋白类癌胚抗原，也是一种广谱肿瘤标志物，存在于多种肿瘤中，如胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等，对胃癌诊断具有较高的灵敏度和特异度[16]，在有些良性疾病如胰腺炎、风湿病等其水平也可能增高。本研究结果显示，RB组与对照组化疗前、化疗3个疗程后、化疗6个疗程后AFP、CEA、CA125、CA724水平比较无差异，RB组化疗前、化疗3个疗程后、化疗6个疗程后AFP、CEA、CA125、CA724水平比较无差异，故认为该4项指标对RB的诊断、疗效监测及预后判断等是无意义的。

综上所述，血清NSE、CA153、CA199水平对RB诊疗有重要意义，可以作为RB的肿瘤标志物。其中NSE水平下降相对较早，更有利于早期诊断RB的复发。但本研究观察时间及样本例数较少，研究结果可能具有一定的局限性，需要增大样本量，并根据病情程度、化疗效果等因素进行分组研究比较，以便更准确地了解各肿瘤标志物在监测化疗疗效以及判断预后等方面的意义。也可选择更多的指标来进行研究，以便寻找到对RB诊疗更有特异性意义的肿瘤标志物。

作者贡献：刘智屏进行文章的构思与设计，撰写论文，进行论文的统计学处理、修订，对文章整体负责，监督管理；刘智屏、李博进行研究的实施与可行性分析；陈俐丽、陈言钊、唐芳政进行数据收集、整理；李博进行结果的分析与解释；刘智屏、张朝霞进行英文的修订；张朝霞负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：崔丽红)

Identification of Tumor Biomarkers for Retinoblastoma

LIUZhi-ping*,LIBo,CHENLi-li,ZHANGZhao-xia,CHENYan-zhao,TANGFang-zheng

DepartmentofPediatrics,ShenzhenPeople′sHospital,2ndClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,Shenzhen518020,China

Background Retinoblastoma(RB) is more common in infants and young children.In general,it is diagnosed at an advanced stage and is prone to recurrence and metastasis and difficult to treat.Objective To identify the tumor biomarkers for RB diagnosis and treatment.Methods From Shenzhen People′s Hospital between August 2014 and August 2016,we recruited the participants of this study〔20 children with RB and complete clinical data undergoing chemotherapy(RB group),and other 20 healthy children undergoing physical examination(control group)〕.The measurement of levels of serum alpha fetoprotein(AFP),carcinoembryonic antigen(CEA),neuron-specific enolase(NSE),carbohydrate antigen(CA) 125,CA153,CA199 and CA724 was performed in the control group during physical examination,and in the RB group before chemotherapy,at the time of completing the third and sixth cycles of chemotherapy,respectively.Results There was no significant difference in AFP,CEA,CA125 and CA724 levels before chemotherapy,at the time of completing the third and sixth cycles of chemotherapy between RB group and the control group(P>0.05). There was no significant difference in NSE level at the time of completing the sixth cycles of chemotherapy between RB group and the control group(P>0.05). NSE level before chemotherapy and at the time of completing the third cycles of chemotherapy in RB group was higher than that in the control group(P<0.05). CA153 and CA199 levels before chemotherapy,at the time of completing the third and sixth cycles of chemotherapy in RB group were higher than those in the control group(P<0.05). There was no significant difference in AFP,CEA,CA125,CA153,CA199 and CA724 levels before chemotherapy,at the time of completing the third and sixth cycles of chemotherapy in RB group(P>0.05). NSE level at the time of completing the sixth cycles of chemotherapy was lower than that before chemotherapy and at the time of completing the third cycles of chemotherapy in RB group(P<0.05). Conclusion Serum NSE,CA153 and CA199 levels are of great significance in the diagnosis and treatment of RB,which can be used as the tumor biomarkers of RB. The level of NSE decreased relatively early,which is more conducive to the early diagnosis of RB recurrence.

Retinoblastoma;Tumor markers,biological;Alpha-fetoproteins;Carcinoembryonic antigen;Neuron-specific enolase;Carbohydrate antigen

深圳市科技研发资金知识创新计划基础研究项目(JCYJ20140416122811998)

R 739.72

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.18.009

2016-12-26；

2017-02-14)

518020 广东省深圳市，深圳市人民医院 暨南大学第二临床医学院儿科

*通信作者：刘智屏，副主任医师；E-mail：lzp97420@163.com

*Correspondingauthor:LIUZhi-ping,Associatechiefphysician;E-mail:lzp97420@163.com